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水溶液中酶含量的分析测定 曾平 03081064. 为什么要测定酶的含量? 酶的应用十分广泛:作为分析试剂(检 测血糖或尿糖浓度, ELISA 体系中作为指 示剂);多种有机化合物的实验室和商 业合成 ( 如从葡萄糖产生果糖 ) ,生物大分 子的降解(如淀粉生成葡萄糖,基因图 谱中 DNA 的特异剪切,低相对分子质量.

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Παρουσίαση με θέμα: "水溶液中酶含量的分析测定 曾平 03081064. 为什么要测定酶的含量? 酶的应用十分广泛:作为分析试剂(检 测血糖或尿糖浓度, ELISA 体系中作为指 示剂);多种有机化合物的实验室和商 业合成 ( 如从葡萄糖产生果糖 ) ,生物大分 子的降解(如淀粉生成葡萄糖,基因图 谱中 DNA 的特异剪切,低相对分子质量."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 水溶液中酶含量的分析测定 曾平

2 为什么要测定酶的含量? 酶的应用十分广泛:作为分析试剂(检 测血糖或尿糖浓度, ELISA 体系中作为指 示剂);多种有机化合物的实验室和商 业合成 ( 如从葡萄糖产生果糖 ) ,生物大分 子的降解(如淀粉生成葡萄糖,基因图 谱中 DNA 的特异剪切,低相对分子质量 化合物的降解),特定生物大分子的合 成(如 PCR 反应中合成 DNA )等。因此 ,很有必要对酶的含量进行测定。

3 酶含量的主要测定方法 双缩脲法双缩脲法双缩脲法 Folin- 酚试剂法 Folin- 酚试剂法 紫外吸收的直接测量法 紫外吸收的直接 测量法 紫外吸收的直接 测量法 结束语

4 该方法基于碱性溶液中 Cu2 + 与蛋白质中 两个邻近肽键的专一性反应。因此,不 同蛋白质之间氨基酸组成的差异不会显 著影响测定结果。

5 1. 配制适当浓度范围的蛋白质标准液(通常为 1~20mg/mL 之间)。 2. 取 1mL 各标准蛋白质溶液分别加在不同的试管中。 [ 用 1mL 蒸馏水或合适的溶液作空白对照。 ] 3. 取 1mL 各待测溶液分别加到不同的试管中。 4. 取 1mL 双缩脲试剂( 1.5gCuSO4·5H2O , 6.0g 酒石 酸钾钠溶解于 300mL 100 mg·mL-1 的 NaOH 中)分别 加到所有的标准液、待测液及空白试剂中。 5. 试管在 37 ℃保温 15min 。 nm 波长处用空白试剂调零,测出各种溶液的吸 光值。 [ 溶液的颜色可保持几小时不变。 ] 双缩脲法的主要缺陷是灵敏度低,因而不适用 于蛋白质浓度小于 1mg/mL 的溶液测定。酶含量的主 要测定方法酶含量的主 要测定方法

6 实验实验材料、主要仪器: ①、 Folin- 酚试剂法包括两步反应:第一步是在碱性条件下,蛋白 质与铜作用生成蛋白质 - 铜络合物;第二步是此络合物将磷钼酸 - 磷钨酸试剂( Folin 试剂)还原,产生深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混 合物),颜色深浅与蛋白质含量成正比。此法操作简便,灵敏度 比双缩脲法高 100 倍,定量范围为 5 ~ 100μg 蛋白质。 Folin 试剂显 色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起,因此样品中若含有酚 类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。此外,不同蛋白质因酪 氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。②、实验材料、 主要仪器:绿豆芽下胚轴(也可用其它材料如面粉)、 722 型(或 721 型)分光光度计、 4 000r/min 的离心机、分析天平、容量瓶( 50mL )、量筒、移液管( 0.5mL 、 1mL 、 5mL )。 ③、试剂 ( 纯度均为分析纯 ) (1)0. 5mol/L NaOH (2) 试剂甲:

7 (A) 称取 10g Na2CO3 , 2g NaOH 和 0.25g 酒石酸钾钠,溶解后用蒸 馏水定容至 500mL 。 (B) 称取 0.5g CuSO4·5H2O ,溶解后用蒸馏水定容至 100mL 。 每次使用前将 (A) 液 50 份与 (B) 液 1 份,即为试剂甲,其有效期为 1d ,过期失效。 ( 3 )试剂乙: 在 1.5L 容积的磨口回流器中加入 100g 钨酸钠 (Na2WO4·2H2O) 和 700mL 蒸馏水,再加 50mL 85 %磷酸和 100mL 浓盐酸充分混匀, 接上回流冷凝管,以小火回流 10h 。回流结束后,加入 150g 硫酸锂 和 50mL 蒸馏水及数滴液体溴,开口继续沸腾 15min ,驱除过量的 溴,冷却后溶液呈黄色 ( 倘若仍呈绿色,再滴加数滴液体溴,继续 沸腾 15min) 。然后稀释至 1L ,过滤,滤液置于棕色试剂瓶中保存 ,使用前大约加水 1 倍,使最终浓度相当于 1mol/L 。

8 实验操作: 1 .标准曲线的制作 ( 1 )配制标准牛血清白蛋白溶液:在分析天平上精确 称取 g 结晶牛血清白蛋白,倒入小烧杯内,用少 量蒸馏水溶解后转入 100mL 容量瓶中,烧杯内的残液 用少量蒸馏水冲洗数次,冲洗液一并倒入容量瓶中, 用蒸馏水定容至 100mL ,则配成 250μg/mL 的牛血清白 蛋白溶液。 ( 2 )系列标准牛血清白蛋白溶液的配制:取 6 支普通 试管,按表 1 加入标准浓度的牛血清白蛋白溶液和蒸馏 水,配成一系列不同浓度的牛血清白蛋白溶液。然后 各加试剂甲 5mL ,混合后在室温下放置 10min ,再各加 0.5 试剂乙,立即混合均匀(这一步速度要快,否则会 使显色程度减弱)。 30min 后,以不含蛋白质的 1 号试 管为对照,用 722 型分光光度计于 650nm 波长下测定各 试管中溶液的光密度并记录结果。

9 标准曲线的绘制:以牛血清白蛋白含量 ( μg )为横坐标,以光密度为纵坐标绘 制标准曲线。

10 样品的提取及测定 ( 1 )准确称取绿豆芽下胚轴 1g ,放入研钵中 ,加蒸馏水 2mL ,研磨匀浆。将匀浆转入离心 管,并用 6mL 蒸馏水分次将研钵中的残渣洗入 离心管,离心 4 000r/min 、 20min 。将上清液转 入 50mL 容量瓶中,用蒸馏水定容到刻度,作 为待测液备用。 ( 2 )取普通试管 2 支,各加入待测溶液 1mL , 分别加入试剂甲 5mL ,混匀后放置 10min ,再 各加试剂乙 0.5mL ,迅速混匀,室温放置 30min ,于 650nm 波长下测定光密度,并记录结果。

11 计算出两重复样品光密度的平均值,从标准曲线中查 出相对应的蛋白质含量 X ( μg ),再按下列公式计算样 品中蛋白质的百分含量。 样品中蛋白质含量(%) = ( X ( μg ) × 稀释倍数/样 品重( g ) ×106 ) *100 另外:进行测定时,加 Folin 试剂要特别小心,因为 Folin 试剂仅在酸性 pH 条件下稳定,但此实验的反应只 是在 pH10 的情况下发生,所以当加试剂乙( Folin 试剂 )时,必须立即混匀,以便在磷钼酸 - 磷钨酸试剂被破 坏之前即能发生还原反应,否则会使显色程度减弱。 酶含量的主要测定方法 酶含量的主要测定方法

12 用于粗略估算的紫外吸收的直接测量法 蛋白质对电磁辐射的最大吸收峰在 280nm 处, 这一特性是直接测量紫外吸收法的基础。该方 法的主要优点是简便非破坏性。核酸是本方法 中最常见的干扰物质,可以通过测定 260nm 处 的吸收值加以校正( 260nm 处,核酸的吸收值 大,而蛋白质的吸收值小) : 蛋白质纯溶液的 A280/A260 值约为 1.8 ,该值会随着核酸含量的 增加而减小。也要注意溶液中任何游离的芳香 族氨基酸在 280nm 处都有吸收,使蛋白质含量 的测定值偏高。含有少量核酸的蛋白质溶液的 最简单的校正步骤如下(要用石英制比色杯) :

13 测定溶液在 280nm 处的吸收值( A280 ) : 若吸收值大于 1 ,适当稀释后重测。 测定 260nm 处的吸收值( A260 )。 用关系式:[蛋白质]( mg/mL ) =1.45 A 280 - 0.74 A 260 。酶含量的主要测定方法酶含量的主要测定方法

14 主要参考文献: 1. 董慧茹等著《复杂物质剖析技术》 2.Allan Jones,Rob Reed and Jonathan Weyers 著 李玲等译《生物学实验技术》 3.Kent K.Stewart Richard E. Ebel 著上官 棣华等译《生物体系中的化学测量》 4. 何锡文等著《分析化学》 《生 物体相关物质的分子识别分析》

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