Η παρουσίαση φορτώνεται. Παρακαλείστε να περιμένετε

Η παρουσίαση φορτώνεται. Παρακαλείστε να περιμένετε

Ηλεκτροφόρηση. ηλεκτροφόρηση – βασικές γνώσεις  Η ηλεκτροφόρηση αναφέρεται στη μετακίνηση κάθε υλικού στοιχείου που φέρει ηλεκτρικό φορτίο, όταν βρίσκεται.

Παρόμοιες παρουσιάσεις


Παρουσίαση με θέμα: "Ηλεκτροφόρηση. ηλεκτροφόρηση – βασικές γνώσεις  Η ηλεκτροφόρηση αναφέρεται στη μετακίνηση κάθε υλικού στοιχείου που φέρει ηλεκτρικό φορτίο, όταν βρίσκεται."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 ηλεκτροφόρηση

2 ηλεκτροφόρηση – βασικές γνώσεις  Η ηλεκτροφόρηση αναφέρεται στη μετακίνηση κάθε υλικού στοιχείου που φέρει ηλεκτρικό φορτίο, όταν βρίσκεται υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου.

3 ηλεκτροφόρηση – βασικές γνώσεις  Οι πρωτείνες είναι αμφολύτες. Αυτό σημαίνει ότι παρουσιάζουν θετικό ή αρνητικό φορτίο ανάλογα με το pH του διαλύματος στο οποίο βρίσκονται.

4 ηλεκτροφόρηση – βασικές γνώσεις  Η αιμοσφαιρίνη (Hb) είναι μια πρω- τείνη του αίματος και έτσι μπορούμε θεωρητικά και πρακτικά να την βά- λουμε σε ένα ηλεκτρικό πεδίο και να την ηλεκτροφορήσουμε.  Κατά την ηλεκτροφόρηση της Hb οι διάφοροι τύποι (A1, A2, F,S) “τρέχουν» με διαφορετική ταχύτητα και έτσι διαχωρίζονται.

5 ηλεκτροφόρηση – βασικές γνώσεις  Με τον όρο «τρέχει» εννοούμε την μετακίνηση των πρωτεϊνικών μορίων πάνω στο υλικό – υπόστρωμα που χρησιμοποιούμε (ταινίες οξικής κυτταρίνης ή cellogel)  H ταχύτητα είναι ανάλογη με το Μ.Β.και το φορτίο κάθε κλάσματος.

6 ηλεκτροφόρηση – βασικές γνώσεις  Η όλη διαδικασία εκτελείται μέσα σε ρυθμιστικό διάλυμα (buffer) με pH=8,9 δηλαδή αλκαλικό οπότε η αιμοσφαιρίνη αποκτά αρνητικό φορτίο και όταν βρεθεί σε ηλεκτρικό πεδίο μετακινείται προς την άνοδο.  Η τεχνική μπορεί να γίνει και σε όξινο buffer με αντίστοιχη μετακίνηση προς την κάθοδο.

7 ηλεκτροφόρηση – υλικά  τα βασικά μέρη μιας συσκευής ηλεκτροφόρησης είναι τα εξής: το λεκανίδιο – λουτρό το τροφοδοτικό

8 ηλεκτροφόρηση – υλικά  Άλλες συσκευές που χρειάζονται για μια ηλεκ- τροφόρηση είναι: Διανομέας του δείγματος. Χρειάζεται για την τοποθέ- τηση συγκεκριμένης ποσότητας δείγματος στο ηλεκ- τροφορητικό υλικό (ταινία) με όσο το δυνατόν πε- ρισσότερη ακρίβεια. Λεκανίδια ειδικά για τον χρωματισμό και αποχρωμα- τισμό της ταινίας. Στεγνωτήριο ταινιών Scanner (Σαρωτής) για την επεξεργασία των αποτε- λεσμάτων.  Τα υλικά αυτά είναι προαιρετικά αλλά απα- ραίτητα για ένα ακριβέστερο αποτέλεσμα.

9 ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός των αιμοσφαιρινών (σε αλκαλικό pH)  Από τις αιμοσφαιρίνες η πιο γρήγορη είναι η HbH, ακολουθεί η HbΑ, λίγο πιο αργή είναι η HbF, και η πιο αργή όλων είναι η HBA2. Κοντά στην HbA2 εμφανίζονται διάφορες παθολογικές αιμοσφαιρίνες και κυρίως η HbS (δρεπανοκυταρική αναιμία).

10 ηλεκτροφόρηση - πορεία  Επιλέγουμε προσεκτικά τη μέθοδο που θα ακολουθήσουμε η οποία εξαρτάται από τον εξοπλισμό που διαθέτει το εργαστήριο (κατασκευαστής, ηλεκτροφορητικό υλικό, κ.α).  Διαβάζουμε και ακολουθούμε προσεκτικά τις οδηγίες χρήσης του κατασκευαστή της μεθόδου.

11 ηλεκτροφόρηση - πορεία  Ετοιμάζουμε όλα τα αντιδραστήρια με μεγάλη ακρίβεια. Η προετοιμασία του ηλεκτροφορητικού μέσου (αγαρόζη ή οξική κυτταρίνη) γίνεται με σχολαστικότητα σύμφωνα με τις οδηγίες.  Γεμίζουμε ίσες ποσότητες ρυθμιστικού διαλύματος στις 2 πλευρές του λεκανιδίου.

12 ηλεκτροφόρηση - πορεία  Τοποθετούμε το δείγμα (αιμόλυμα) πάνω στην ταινία με τη βοήθεια του διανομέα. Ο διανομέας είναι μια συσκευή που μας βοηθάει να τοποθετούμε κάθε φορά την ίδια ποσότητα δείγματος και ομοιόμορφα.  Το δείγμα μπαίνει πάντα από τη μεριά της καθόδου (-).

13 ηλεκτροφόρηση - πορεία  Στερεώνουμε την ταινία στις ειδικές υποδοχές φροντίζοντας να είναι βυθισμένα και τα δύο άκρα στο ρυθμιστικό διάλυμα.

14 ηλεκτροφόρηση - πορεία  Συνδέουμε με το τροφοδοτικό. Μια ματιά στο εγχειρίδιο χρήσης του μηχανήματος είναι πάντα χρήσιμη για τη ρύθμιση των παραμέτρων της ηλεκτροφόρησης (Volts, Ampers κ.α)

15 ηλεκτροφόρηση - πορεία

16  Αφήνουμε το ρεύμα να περάσει για όση ώρα λένε οι οδηγίες.  Βγάζουμε την ταινία και την περνάμε από όλα τα στάδια χρωματισμού και αποχρωματισμού χρησιμοποιώντας τα ειδικά λεκανίδια.

17 ηλεκτροφόρηση - πορεία  Το τελικό αποτέλεσμα είναι κάπως έτσι:

18 ηλεκτροφόρηση - πορεία  Το αποτέλεσμα της ηλεκτροφόρησης δίνεται ως η εκατοστιαία (%) αναλο- γία των επιμέρους κλασμάτων που εμφανίστηκαν στην ηλεκτροφόρηση.  Ένας φυσιολογικός ενήλικας έχει 97,5% HbA και 1,5 – 3,5% HbA2 και 0 – 2% HbF (εμβρυϊκή).  Ένα φυσιολογικό νεογνό έχει 60 – 90% HbF και το υπόλοιπο HbA2

19 ηλεκτροφόρηση - πορεία  Για να υπολογίσουμε την % αναλογία του κάθε κλάσματος εργαζόμαστε ως εξής: Ετοιμάζουμε σειρά δοκιμαστικών σω- λήνων όσα είναι τα κλάσματα που διαχωρίστηκαν + 1 ακόμα που θα το χρησιμοποιήσουμε σαν Τυφλό. Βάζουμε σε όλα τα σωληνάρια 1 ml διαλύματος έκλουσης.

20 ηλεκτροφόρηση - πορεία Διαχωρίζουμε προσεκτικά σε ίσα μεγέθη τα κλάσματα με ένα ψαλίδι. Υστερα κόβουμε ένα, ίσων διαστάσεων, κομμάτι διαυγούς ταινίας (χωρίς κλάσμα αιμοσφαιρίνης).

21 ηλεκτροφόρηση - πορεία Βυθίζουμε μέσα στο διάλυμα των σωλη- ναρίων με λαβίδα ένα – ένα τα κομμάτια της ταινίας σημειώνοντας στα σωληνάρια τα κλάσματα που έχουμε βάλει. Στο σωληνάριο με την ένδειξη Τ βάζουμε το διαυγές κομμάτι της ταινίας, το οποίο θα χρησιμοποιήσουμε για μηδενισμό του φωτομέτρου. Ανακινούμε τα σωληνάρια για 15 λεπτά μέχρι να διαλυθεί τελείως η ταινία.

22 ηλεκτροφόρηση - πορεία Η ένταση του χρώ- ματος του κάθε σωληναρίου είναι ανάλογη του ποσού της αιμοσφαιρίνης κάθε κλάσματος. Μηδενίζουμε με το Τυφλό και φωτομε- τρούμε όλα τα σω- ληνάρια σε λ = 540 nm.

23 ηλεκτροφόρηση - πορεία  Υπολογίζουμε το % ποσοστό κάθε κλάσματος εφαρμόζοντας τον τύπο: % ποσοστό κλάσματος = απορρόφηση κλάσματος / άθροισμα απορροφήσεων όλων των κλασμάτων * 100.  Εάν διαθέτουμε ένα ειδικό μηχάνημα που λέγεται scanner (σαρωτής) τότε το αποτέλεσμα δίνεται αυτόματα σε ποσοστό καθώς και σε γραμμικό διάγραμμα.


Κατέβασμα ppt "Ηλεκτροφόρηση. ηλεκτροφόρηση – βασικές γνώσεις  Η ηλεκτροφόρηση αναφέρεται στη μετακίνηση κάθε υλικού στοιχείου που φέρει ηλεκτρικό φορτίο, όταν βρίσκεται."

Παρόμοιες παρουσιάσεις


Διαφημίσεις Google