Η παρουσίαση φορτώνεται. Παρακαλείστε να περιμένετε

Η παρουσίαση φορτώνεται. Παρακαλείστε να περιμένετε

Ενζυμική Βιοτεχνολογία Τεχνολογία Καθαρισμού Ενζύμων.

Παρόμοιες παρουσιάσεις


Παρουσίαση με θέμα: "Ενζυμική Βιοτεχνολογία Τεχνολογία Καθαρισμού Ενζύμων."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Ενζυμική Βιοτεχνολογία Τεχνολογία Καθαρισμού Ενζύμων

2 Κατάταξη Ενζύμων με βάση τον όγκο παραγωγής και αγοράς Μεγάλου όγκου ή βιομηχανικά ένζυμα (industrial enzymes) Μικρού όγκου ή υψηλής προστιθέμενης αξίας ένζυμα (high added value enzymes) Εξωκυτταρικά ένζυμα (συνήθως) Χαμηλή καθαρότητα Μεγάλες ποσότητες παραγωγής Φθηνό κόστος παραγωγής και αγοράς Ενδοκυτταρικά ένζυμα (συνήθως) Υψηλή καθαρότητα Μικρές ποσότητες παραγωγής Ακριβό κόστος παραγωγής και αγοράς

3 Προέλευση Ενζύμων Ζωικής Προέλευσης Λιπάση (πάγκρεας χοίρου, βιομηχανία καλλυντικών) Θρυψίνη (πάγκρεας μόσχου και χοίρου, επεξεργασία δέρματος) Αφυδρογονάσες (καρδιακό ή σκελετικό μυ θηλαστικών, διαγνωστική και αναλυτική επιστήμη) Φυτικής Προέλευσης Παπαΐνη (Carica Papaya, ζυθοποιία) Οξαλοξική οξειδάση (ρίζες κριθαριού, προσδιορισμός οξαλοξικού οξέος) Υπεροξειδάση (ραφανίδα, ένζυμο δείκτης ενζυμικών αντιδράσεων) Μικροβιακής Προέλευσης Περιοριστικά ένζυμα (διάφοροι μικροοργανισμοί, μοριακή βιολογία)

4 Ετερόλογα Συστήματα Έκφρασης Πρωτεϊνών Τι είναι; Συστήματα παραγωγής πρωτεϊνών ως αποτέλεσμα έκφρασης ανασυνδυασμένων γονιδίων που κωδικοποιούν τα επιθυμητά πολυπεπτίδια Πλασμιδιακοί φορείς έκφρασης διατηρούν και εκφράζουν τα επιθυμητά ανασυνδυασμένα γονίδια στα συστήματα έκφρασης Συστήματα έκφρασης: προκαρυωτικοί και ευκαρυωτικοί μικροοργανισμοί, κυτταροκαλλιέργειες ανώτερων οργανισμών, φυτά, ζώα, cell-free συστήματα έκφρασης...

5 Ετερόλογη Έκφραση: Τι χρειαζόμαστε;

6 Cell-free Bacterial YeastInsect Mammalian Συστήματα Έκφρασης Πρωτεϊνών Transgenic animals Transgenic plants

7 Κύριες εφαρμογές: Παραγωγή πρωτεϊνών που συναντώνται σε χαμηλές ποσότητες στις φυσικές πηγές, για άμεση απομόνωση και λειτουργική-δομική τους ανάλυση. Βιομηχανική παραγωγή πρωτεϊνών για βιοφαρμακευτική χρήση. Χαρακτηρισμό πρωτεϊνών που έχουν ανιχνευθεί μέσω τεχνικών reverse genetics. Δομική και λειτουργική ανάλυση πρωτεϊνών χρησιμοποιώντας τεχνικές μεταλλαξογέννεσης Παραγωγή πρωτεϊνών με νέες ιδιότητες εφαρμόζοντας τεχνικές πρωτεϊνικής μηχανικής Ετερόλογα Συστήματα Έκφρασης Πρωτεϊνών

8 Γενετικά ανασυνδυασμένοι μικροοργανισμοί Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus nidulans Aspergilus niger, Aspergillus oryzae, Pishia pastoris ……… Τεχνική κλωνοποίησης ανασυνδυασμένου DΝΑ PCR στο αντίστοιχο γένωμα Μετασχηματισμός Κυττάρων έκφρασης Αντίδραση συγκόλλησης Επιλογή πλασμιδιακού φορέα έκφρασης Επαγωγή υπερέκφρασης

9 Escherichia coli: το πιο χρησιμοποιημένο βακτήριο για την παραγωγή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών Ετερόλογα Συστήματα Έκφρασης Πρωτεϊνών Γρήγορο, φθηνό, εύκολο (όταν δουλεύει) Εύκολη κλωνοποίηση και γενετική τροποποίηση Μικρός κόστος καλλιέργειας Γρήγορη ανάπτυξη και έκφραση

10 Ετερόλογα Συστήματα Έκφρασης Πρωτεϊνών Βασικά βήματα παραγωγής ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών: Απομόνωση και πολλαπλασιασμός του γονιδίου στόχου (PCR) Μεταφορά του γονιδίου σε πλασμιδιακό φορέα έκφρασης (pET) Μετασχηματισμός E. coli κυτταρικής σειράς έκφρασης (Bl21DE3) Μικρής κλίμακας υπερέκφραση Έλεγχος έκφρασης της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης (ενζυμική δοκιμή, western blot) Μεγάλης κλίμακας υπερέκφραση Απομόνωση πρωτεΐνης (Χρωματογραφία)

11 Παραγωγή ανθρώπινων πρωτεϊνών μέσω γενετικά ανασυνδυασμένων μικροοργανισμών ΠρωτεΐνηΠαθήσεις α1-Αντιθρυψίνη Εμφύσημα Αδρενοκοτρικοτροπική ορμόνη Ρευματικές Παθήσεις Παράγοντας VIII Αιμοφιλία Παράγοντας ΙΧ Αιμοφιλία Ενδορφίνες Πόνος Αιμογλοβίνη Αναιμία Ινσουλίνη Διαβήτης Λεμφοτοξίνη Καρκίνος Αυξητική ορμόνη Αναπτυξιακά προβλήματα Ιντερλευκίνες Καρκίνος, Ανοσολογικές παθήσεις Ιντερφερόνες (α, β, γ) Ιώσεις, Καρκίνος Επιδερμικός αυξητικός παράγοντας Εγκαύματα Νευρικός αυξητικός παράγοντας Τραύματα νευρώνων

12 Οργανισμός (Πηγή πρωτεΐνης) Ανιούσα Επεξεργασία (Έκφραση πρωτεΐνης) Κατιούσα Επεξεργασία (Απομόνωση και καθαρισμός πρωτεΐνης) Καθαρό Πρωτεϊνικό Παρασκεύασμα

13 Κατιούσα Επεξεργασία Αρχικό Στάδιο Διαχωρισμός Στερεών και Υγρών Στάδιο Χαμηλού Καθαρισμού Στάδιο Υψηλού Καθαρισμού Τελικό Στάδιο Μορφοποίηση Προϊόντος

14 Αρχικό Στάδιο Διαχωρισμού Στερεών και Υγρών Φυγοκέντρηση σε ειδικά δοχεία Φυγοκέντρηση συνεχούς ροής Φυγοκέντρηση Ίζημα : Ενδοκυτταρικές, μεβρανικές πρωτεΐνες Υπερκείμενο : Εξωκυτταρικές πρωτεΐνες

15 Αρχικό Στάδιο Διαχωρισμού Στερεών και Υγρών Υπερδιήθηση: 0, μm Διήθηση Μικροδιήθηση : 0,005-2μm

16 Διάρρηξη Κυττάρων Μη Μηχανικές Τεχνικές Ωσμωτικό σοκ Αλκαλική λύση (pH 11-12,5) Χρήση επιφανειοδραστικών ή τασιενεργών ενώσεων (Tween, Triton) Οργανικοί διαλύτες (τολουόλιο, ακετόνη) Ενζυμική λύση (λυσοζύμη) Μηχανικές Τεχνικές Εφαρμογή υπερήχων Εφαρμογή υψηλής πίεσης Μηχανικός θρυμματισμός με κόκκους

17 Μηχανικές Τεχνικές διάρηξης κυττάρων Εφαρμογή υπερήχων Sonicator

18 Μηχανικές Τεχνικές διάρηξης κυττάρων Εφαρμογή υψηλής πίεσης French Press Cell Press

19 Μηχανικές Τεχνικές διάρηξης κυττάρων Μηχανικός θρυμματισμός με κόκκους Glass beads

20 Στάδιο Χαμηλού Καθαρισμού Κατακρήμνιση με άλατα Κατακρήμνιση με οργανικούς διαλύτες Κατακρήμνιση σε υδατικά διφασικά συστήματα Θερμική Επεξεργασία Απομάκρυνση νουκλεϊκών οξέων (πολυαιθυλενιμίδιο, θειική στρεπτομυκίνη, βρωμιούχο κετυλο τριμεθυλαμμώνιο, πρωταμίνη, δεοξυριβονουκλεάση)

21 Στάδιο Υψηλού Καθαρισμού Χρωματογραφία Διαπερατότητας (gel filtration) Χρωματογραφία Ιοντοανταλλαγής (Ion exchange chromatography) Χρωματογραφία Συγγένειας (Affinity chromatography) Χρωματογραφία Υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων (Hydrophobic interaction)

22 Στάδιο Υψηλού Καθαρισμού Fast protein liquid chromatography FPLC

23 Τελικό Στάδιο Μορφοποίησης Προϊόντος Απομάκρυνση μικρομοριακών ουσιών (υπερδιήθηση, χρωματογραφία διαπερατότητας) Προσθήκη σταθεροποιητών ενζυμικής ενεργότητας (γλυκερόλη, άλατα, υπόστρωμα, αλβουμίνη…) Ποιοτικός έλεγχος πρωτεϊνών (ανάλογα με τις προδιαγραφές χρήσεις)

24 Minotech Παραγωγική μονάδα του Ινστιτούτου Μοριακής Βιολογίας και Βιοτεχνολογίας απο το 1987 (πιστοποίηση IS0 9001:2008) Απομόνωση πρωτεϊνών ετερόλογα εκφρασμένων σε βακτήρια. Προϊόντα: Restriction Enzymes DNA Modifying Enzymes Nucleic Acids and Markers Cytokines Specialty Enzymes Antibodies ReagentsRestriction EnzymesDNA Modifying EnzymesNucleic Acids and MarkersCytokinesSpecialty EnzymesAntibodiesReagents


Κατέβασμα ppt "Ενζυμική Βιοτεχνολογία Τεχνολογία Καθαρισμού Ενζύμων."

Παρόμοιες παρουσιάσεις


Διαφημίσεις Google