Βιοτεχνολογία Ονοματεπώνυμο: Βασίλειος Μπουρατζής Α.Μ: 4893 Έτος:2011-2012 Εξάμηνο: δ’ Υπεύθυνη καθηγήτρια: Μαρία Φράγκου.

Παρουσίαση με θέμα: "Βιοτεχνολογία Ονοματεπώνυμο: Βασίλειος Μπουρατζής Α.Μ: 4893 Έτος:2011-2012 Εξάμηνο: δ’ Υπεύθυνη καθηγήτρια: Μαρία Φράγκου."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Βιοτεχνολογία Ονοματεπώνυμο: Βασίλειος Μπουρατζής Α.Μ: 4893 Έτος:2011-2012 Εξάμηνο: δ’ Υπεύθυνη καθηγήτρια: Μαρία Φράγκου

2 Cell magazine Volume 144, Issue 5 4 March 2011,pages 796-809

3 “Ενδοκρινής ρύθμιση της αντρικής γονιμότητας από το σκελετό”

4 Σχηματισμός και αποδόμηση των οστών Το οστό είναι ένας δυναμικός ιστός Υποβάλλεται σε μορφοποίηση κατά τη διάρκεια της παιδικής ηλικίας και αναδιαμορφώνεται κατά τη διάρκεια της ενήλικης ζωής Οι 2 αυτές διαδικασίες χαρακτηρίζονται από την διαδοχική οστική αποδόμηση και από τον de novo σχηματισμό από τους οστεοβλάστες

5 Οι παραπάνω διαδικασίες ρυθμίζονται σε τοπικό επίπεδο από κυτταροκίνες που παράγονται από κύτταρα των οστών και συστηματικά από ορμόνες και νευροπεπτιδια. Ένας από τους πιο ισχυρούς ορμονικούς ρυθμιστές είναι τα στεροειδή ορμονών που είναι απαραίτητα για τη διατήρηση της ακεραιότητας των οστών Η βιολογική σημασία του γεγονότος αυτού είναι ότι η έλλειψη γονάδων προκαλεί οστική απώλεια οστεοπόρωση κυρίως σε μετεμμηνοπαυσικές γυναίκες.

6 Με βάση τις κλινικές και φυσιολογικές παρατηρήσεις οι επιστήμονες υπέθεσαν πριν 10 χρόνια ότι : 1. η μάζα των οστών 2. ο μεταβολισμός της ενέργειας 3. η αναπαραγωγή ρυθμίζονται με συντονισμένη κίνηση

7 Λειτουργίες των οστών Από δοκιμές που έγιναν βρέθηκε ότι τα οστά είναι ένα ενδοκρινές όργανο που ευνοεί σε ολόκληρο το σώμα την ομοιόσταση της γλυκόζης και των ενεργειακών δαπανών Οι παραπάνω λειτουργίες των οστών με τη μεσολάβηση ενός συγκεκριμένου εκκριτικού μορίου του οστεοβλάστη την οστεοκαλσίνη η οποία όταν αποκαρβοξυλιώνεται λειτουργεί ως ορμόνη που ευνοεί τον πολλαπλασιασμό 1. των κυττάρων β, 2. την έκκριση ινσουλίνης 3. και την ενεργειακή δαπάνη

8 Ένα δεύτερο γονίδιο που εκφράζεται σε οστεοβλάστες, το ESP, αναστέλλει τις ενδοκρινικές λειτουργίες της οστεοκαλσίνης Έτσι μέσω ενός μηχανισμού ευνοείται η καρβοξυλίωση της

9 Οστεοκαλσίνη ευνοεί την αντρική γονιμότητα Αυτό επιτυγχάνεται : Με την προώθηση από τη σύνθεση των κύτταρων Leydig της τεστοστερόνης, είναι μια στεροειδής ορμόνη που απαιτείται σε πολλές πτυχές της λειτουργιάς των όρχεων

10 Επιπλέον εντοπίστηκε μια εκδοχή του υποδοχέα της οστεοκαλσίνης που εκφράζεται και μεταδίδει σήμα στα κύτταρα Leydig Έτσι χρησιμοποιώντας τα παραπάνω δεδομένα βρεθήκαν τα γονίδια των οποίων η έκφραση ρυθμίζεται από την οστεοκαλσίνη Ο σκελετός είναι ρυθμιστής της αντρικής γονιμότητας

11

12 Οι οστεοβλάστες προωθούν την αύξηση της παραγωγής τεστοστερόνης από τα κύτταρα Leydig Σε μια προσπάθεια να διαπιστωθεί αν οι οστεοβλάστες ή άλλα κύτταρα μεσεγχυματικής προέλευσης μπορούν να ρυθμίζουν τις λειτουργιές των γονάδων, οι επιστήμονες έψαξαν για το αν τα υπερκείμενα των μεσεγχυματικών κυτταρικών καλλιεργειών επηρεάζουν την παραγωγή ορμονών από τους όρχεις

13 Πειραματική διαδικασία που ακολουθήθηκε Βήματα που ακολουθηθήκαν Σχηματική αναπαράσταση των κύτταρων που χρησιμοποιούνται για το προσδιορισμό του ρόλου των μεσεγχυματικών κυττάρων στην παραγωγή στεροειδών ορμονών για κάθε φύλο Τα διάφορα μεσεγχυματικά κύτταρα από ποντίκια καλλιεργούνται μαζί με τα κύτταρα Leydig Τα παράγωγα τους συλλέγονται μετά από 24 ώρες Κύτταρα των όρχεων ή των ωοθηκών ή τα πρωτογενή κύτταρα Leydig καλλιεργούνται για 1 ώρα με τα υπερκείμενα αυτά

14 Στη συνεχεία… Χρησιμοποιήθηκαν ραδιοανοσολογικά για την μέτρηση των επιπέδων τεστοστερόνης οιστροδιόλης και προγεστερόνης Από τα πειράματα φαίνεται ότι αυξήθηκε σημαντικά η έκκριση τεστοστερόνης(B) από τους όρχεις των εκφύτων Ενώ δεν επηρεάστηκε η έκκριση οιστροδιόλης(C) και προγεστερόνης (D)

15 Η ίδια διαδικασία ακολουθήθηκε και για τις ωοθήκες όπου είχαμε τα ίδια αποτελέσματα

16 Δεδομένου ότι η τεστοστερόνη παράγεται από κύτταρα Leydig ρωτήσαμε αν τα οστεοπλαστικά προερχόμενα μόρια δρουν απευθείας στα κύτταρα Leydig Καλλιεργήσαμε κύτταρα Leydig ποντικού με την παρουσία ή την απουσία υπερκείμενων των καλλιεργειών των οστεοβλαστών ή και άλλων καλλιεργειών κυττάρων Τα αποτελέσματα που πήραμε είναι ότι τα μόνα που κατάφεραν να αυξήσουν σημαντικά την παραγωγή τεστοστερόνης από τα κύτταρα Leydig ήταν οι καλλιέργειες οστεοβλαστών

17 Συμπέρασμα Τα πειράματα έδειξαν ότι οι οστεοβλάστες είναι κύτταρα μεσεγχυματικής προέλευσης που επηρεάζουν την βιοσύνθεση της τεστοστερόνης Έτσι η ενδοκρινική λειτουργιά των οστεοβλαστών ήταν αποκλειστικά για την παραγωγή ανδρογόνων.

18 Η οστεοκαλσίνη ευνοεί την αντρική γονιμότητα με την ενίσχυση της παραγωγής τεστοστερόνης Στη συνέχεια προσπάθησαν να αποδείξουν αν η οστεοκαλσίνη που προέρχεται από τους οστεοβλάστες ενισχύει την έκκριση τεστοστερόνης από τα κύτταρα Leydig

19 Έτσι προκύπτουν τα εξής αποδεικτικά στοιχεία Παραγωγή τεστοστερόνης από κύτταρα Leydig τα οποία έχουν καλλιεργηθεί με την παρουσία WT και Ocn οστεοβλαστών Τα υπερκείμενα των WT και όχι των Οcn καλλιεργειών οστεοβλαστών είναι αυτά που ενισχύουν την παραγωγή τεστοστερόνης

20 Παραγωγή τεστοστερόνης από κύτταρα Leydig με αυξανόμενη έγχυση οστεοκαλσίνης Βάζοντας σε κύτταρα Leydig ένα αυξανόμενο ποσό αποκαρβοξυλιωμένης οστεοκαλσίνης (δραστική μορφή της ορμόνης) είχαμε μια δοσοεξαρτώμενη αύξηση της έκκρισης τεστοστερόνης Παρ’ όλα αυτά σε υψηλή συγκέντρωση η διεγερτική επίδραση της οστεοκαλσίνης αποδυναμώνεται

21 Βρέθηκε ότι η έγχυση οστεοκαλσίνης σε ποντικούς WT αυξάνει τα επίπεδα τεστοστερόνης Έτσι έγιναν πειράματα οπού παρακολουθήθηκαν τα επίπεδα τεστοστερόνης σε 1 ώρα σε 4 και σε 8 ώρες μετά την εισαγωγή οστεοκαλσίνης με ένεση

22 Σύγκριση μεταξύ των νεογνών Όταν τα Ocn αρσενικά ποντίκια διασταυρώθηκαν με WT θηλυκά το μέγεθος των νεογνών ήταν 2 φορές μικρότερο απ’ ότι όταν αρσενικά WT διασταυρώνονται με θηλυκά WT

23 Αντίθετα ο αριθμός των νεογνών ανά γεννά αυξήθηκε όταν διασταυρώθηκαν Esp αρσενικά με WT παρ’ όλο που η αύξηση δεν ήταν στατιστικά σημαντική

24 Το μέγεθος και το βάρος των όρχεων μειώθηκε σημαντικά στα Ocn ποντίκια ενώ αυξήθηκε στα Esp ποντίκια σε ηλικία 3 μηνών

25 Το βάρος της επιδιδυμίδας των σπερματοδόχων κύστεων και του αριθμού των σπερματοζωαρίων ήταν σημαντικά μειωμένα σε Ocn ποντίκια ενώ αυξήθηκε σε αυτά με το Esp

26 Η οστεοκαλσίνη ρυθμίζει την αντρική γονιμότητα ως μια ορμόνη που προέρχεται από τους οστεοβλάστες Για να αποδείξουμε ότι η οστεοκαλσίνη ρυθμίζει την αντρική γονιμότητα ως μια ορμόνη προερχόμενη από οστεοβλάστη και όχι ως ένα παράγοντα που εκκρίνεται από τους όρχεις πραγματοποιήθηκαν πειράματα 1. όπου μελετήθηκε η έκφραση των γονιδίων 2. Και άλλα τα οποία τα γονίδια απενεργοποιήθηκαν

27 Μετά από PCR είδαμε ότι η οστεοκαλσίνη βρισκόταν σε μεγαλύτερη ποσότητα στα οστά απ’ ότι στις γονάδες

28 ανάλυση Western Blot της οστεοκαλσίνης στο μηρό, και των όρχεων. Επίσης δεν βρήκαμε ίχνη οστεοκαλσίνης στους όρχεις ύστερα από την εφαρμογή της τεχνικής Western blot κ του situ υβριδισμού

29 Κυτταρική και μοριακή βάση της ρύθμισης της οστεοκαλσίνης για την αντρική γονιμότητα Για πρώτη φορά μελετήθηκε η μορφολογία των κύτταρων Leydig μέσω ανοσολογικής χρώσης την 3-β- υδροξυστεροειδικη αφυδρογονάση (3β-Hsd) Ο αριθμός των κυττάρων Leydig δεν επηρεάστηκε σημαντικά από την απουσία της οστεοκαλσίνης ή του Esp γονιδίου Επίσης η έκφραση των γονιδίων δεν επηρέασε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων

30 Παρ’ όλα αυτά τα κύτταρα Leydig εμφανίστηκαν υποτροφίκα στους Ocn όρχεις αφού υπήρχε σημαντική μείωση της αναλογίας μεταξύ των κυττάρων Leydig και τις διάμεσες περιοχές στους Ocn και στους WT όρχεις Αντίθετα το ποσοστό αυτό αυξήθηκε σε ESP όρχεις

31

32 Gprc6a ένας G protein-coupled receptor που μεταφέρει το σήμα της οστεοκαλσίνης σε κύτταρα Leydig Για να βρεθεί ο μοριακός τρόπος δράσης της οστεοκαλσίνης μελετήθηκε ένας υποδοχέας που εκφράζεται στα κύτταρα Leydig και κάνει την μεταγωγή του σήματος Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήσαμε 2 σταδία πειραματικής στρατηγικής βασιζόμενοι πάντα στο γεγονός ότι η οστεοκαλσίνη ρυθμίζει μονό τη γονιμότητα στα αρσενικά ποντίκια

33 1. Ορίσαμε το μονοπάτι μεταγωγής σήματος που χρησιμοποιεί η οστεοκαλσίνη (αυτό έγινε σε TM3 κύτταρα και όχι σε πρωτογενή κύτταρα Leydig προκειμένου να αποκτήσουν επαρκή όγκο εκχυλίσματος για ανάλυση) Στη συνεχεία παρατηρήθηκε ότι η οστεοκαλσίνη προκαλεί την παραγωγή cAMP στα κύτταρα Leydig Σε υψηλότερες συγκεντρώσεις η οστεοκαλσίνη αποδυναμώνεται από τη διαίρεση παράγωγης cAMP Τα στοιχειά αυτά μας δείχνουν ότι ο υποδοχέας της οστεοκαλσίνης είναι μια πρωτεΐνη G σε συνδυασμό με υποδοχέα Gpcr

34 Στο δεύτερο στάδιο εκμεταλλευτήκαμε την διχοτόμηση της λειτουργιάς της οστεοκαλσίνης μεταξύ των ανδρών και των γυναικών και βρήκαμε ότι περισσότερα Gprc εκφράζονται στους όρχεις απ ότι στις ωοθήκες Περίπου 5 φορές περισσότερα Τέλος πειράματα ανοσοφθορισμου επαλήθευαν ότι η Gprc6a εκφράζεται σε κύτταρα Leydig των όρχεων

35

36 Creb είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας της σηματοδότησης της οστεοκαλσίνης στα κύτταρα Leydig