ΠΡΩΤΕΟΛΥΤΙΚΗ ΚΑΤΑΤΜΗΣΗ (ECTODOMAIN SHEDDING) ΤΗΣ VE-CADHERIN ΣΤΟ ΕΝΔΟΘΗΛΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΓΕΝΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ-ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ.

Παρουσίαση με θέμα: "ΠΡΩΤΕΟΛΥΤΙΚΗ ΚΑΤΑΤΜΗΣΗ (ECTODOMAIN SHEDDING) ΤΗΣ VE-CADHERIN ΣΤΟ ΕΝΔΟΘΗΛΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΓΕΝΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ-ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 ΠΡΩΤΕΟΛΥΤΙΚΗ ΚΑΤΑΤΜΗΣΗ (ECTODOMAIN SHEDDING) ΤΗΣ VE-CADHERIN ΣΤΟ ΕΝΔΟΘΗΛΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΓΕΝΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ-ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ 29 Οκτωβριου 2011

2 (Verheul and Pinedo 2007) (Aird 2007).  Μονοστοιβάδα των ενδοθηλιακών κυττάρων που επενδύουν τα αιμοφόρα αγγεία και σχηματίζουν ένα ημι-διαπερατό φραγμό ανάμεσα στο πλάσμα του αίματος και τον ενδιάμεσο ιστό (interstitium). Εισαγωγή - Ενδοθήλιο Ενδοθήλιο - Δομή και ιδιότητες Vestweber et al., Trends in Cell Biology, 2008 ρύθμιση του αγγειοκινητικού τόνου διήθηση των λευκοκυττάρων αγγειογένεση φυσική και επίκτητη ανοσία ρύθμιση ενδοθηλιακής διαπερατότητας ρύθμιση του αγγειοκινητικού τόνου διήθηση των λευκοκυττάρων αγγειογένεση φυσική και επίκτητη ανοσία ρύθμιση ενδοθηλιακής διαπερατότητας Λειτουργίες PECAM-1 MRP-14

3 Εισαγωγή - Ενδοθήλιο Ενδοθηλιακή διαπερατότητα Διακυτταρική διαδρομή διαμέσου των ενδοθηλιακών κυττάρων Παρακυτταρική διαδρομή διαμέσου των συνδέσμων των ενδοθηλιακών κυττάρων 1. 2. (Weis 2008)

4 Αγγειακή Ενδοθηλιακή Καδερίνη (VE-Cadherin) Διακυτταρικοί σύνδεσμοι (Dejana, Tournier-Lasserve et al. 2009) Εξωκυτταρική περιοχή Κυτταροπλασματική περιοχή Δομικό ρόλο  Δημιουργία AJs  Έλεγχος ενδοθηλιακής διαπερατότητας Σηματοδοτικό ρόλο  Αγγειογένεση  Πολλαπλασιασμός  Διήθηση λευκοκυττάρων Διατήρηση της αγγειακής ομοιόστασης

5 Διακυτταρικοί σύνδεσμοι (Dejana, Tournier-Lasserve et al. 2009) Παράγοντες διαπερατότητας Επίδραση στη VE- Cadherin VEGF Φωσφορυλίωση Διακύττωση Αποδέσμευση κατενίνης Θρομβίνη Φωσφορυλίωση Αποδέσμευση κατενίνης Ισταμίνη Φωσφορυλίωση Διακύττωση Αποδέσμευση κατενίνης TΝF-αΦωσφορυλίωση ΛιποσακχαρίτεςΦωσφορυλίωση Δραστικές ρίζες οξυγόνουΦωσφορυλίωση Αποδέσμευση κατενίνης (Gavard 2009) VE-Cadherin και ενδοθηλιακή διαπερατότητα

6 Ectodomain shedding Πρωτεολυτική κατάτμηση Shedding  Η πρωτεολυτική διάσπαση μεμβρανικών μορίων από πρωτεάσες του εξωκυττάριου χώρου και η απελευθέρωση διαλυτών εξωκυτταρικών τμημάτων. 1.ADAMs (A Disintegrin And Metalloprotease) 2.MMPs (Matrix MetalloProteases) 3.διαλυτές πρωτεάσες σερίνης (ελαστάση) 1.ADAMs (A Disintegrin And Metalloprotease) 2.MMPs (Matrix MetalloProteases) 3.διαλυτές πρωτεάσες σερίνης (ελαστάση) (Reiss and Saftig 2009) Βιολογικά ενεργό ?

7 Ectodomain shedding Πρωτεολυτική κατάτμηση της VE-Cadherin (Schulz, Pruessmeyer et al. 2008)  Παράγοντες αύξησης ενδοθηλιακής διαπερατότητας (θρομβίνη) ADAM10 Πρωτεολυτική κατάτμηση διαλυτή VE-Cadherin Shedding της VE-Cadherin Διήθηση λευκοκυττάρων Ενεργοποίηση της ADAM10 Αύξηση ενδοθηλιακής διαπερατότητας

8 Ectodomain shedding Πρωτεολυτική κατάτμηση-Βιολογικές διεργασίες  Διαφοροποίηση  Διήθηση λευκοκυττάρων  Σηματοδότηση  Φλεγμονή  ασθένειες  Διαφοροποίηση  Διήθηση λευκοκυττάρων  Σηματοδότηση  Φλεγμονή  ασθένειες Απελευθέρωση CTF Ectodomain Shedding N-Cadherin Κυτταροπλασματική συσσώρευση β-κατενίνης Μεταγραφή ογκογονιδίων (C-myc, C-jun) Ανεξέλεγκτος πολλαπλασιασμός (Reiss, Maretzky et al. 2005)

9 median 1.13 ng/ml, range 0.40 – 2.24 ng/ml median 2.64 ng/ml, range 1.34 – 3.94ng/ml n= 13

10 Fig1. Plasma concentrations of vascular endothelial (VE)-cadherin in the peripheral and coronary sinus blood samples of control subjects and patients with AMI, AP, and OMI. Values are mean±SD. **p<0.01 vs Control; *p<0.05 vs control. AMI, acute myocardial infarction; AP, angina pectoris; OMI, old myocardial infarction. 2,6 ng/ml 4,5-5 ng/ml n=24 n=26 n=18 n=30

11 Διαλυτή VE-Cadherin - Ασθένειες Ectodomain shedding Πρωτεολυτική κατάτμηση Διαλυτή VE-Cadherin στεφανιαία αθηροσκλήρωση (Soeki et al., 2004) στεφανιαία αθηροσκλήρωση (Soeki et al., 2004) σύνδρομο υπερδιέγερσης των ωοθηκών (Villasante, Pacheco et al. 2008) σύνδρομο υπερδιέγερσης των ωοθηκών (Villasante, Pacheco et al. 2008) οξεία σήψη (Zhang, Liu et al., 2010) οξεία σήψη (Zhang, Liu et al., 2010)  Ο μηχανισμός πρωτεολυτικής κατάτμησης της VE-Cadherin δεν έχει αποσαφηνιστεί. ADAMs ?

12 Παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι του εξωκυτταρικού τμήματος της VE-Cadherin. Χαρακτηρισμός των αντισωμάτων. 1.Άμεση ανίχνευση της διαλυτής VE-Cadherin στην κυκλοφορία του αίματος φυσιολογικών και παθολογικών ατόμων. Παρασκευή σφαιριδίων συγγένειας. Ανοσοκατακρήμνιση έναντι της VE-Cadherin σε ορούς ασθενών της ΜΕΘ.

13 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ Παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι του εξωκυτταρικού τμήματος της VE-Cadherin. «κύτταρα υβριδώματα» Καλλιέργεια Συλλογή υπερκείμενου Χαρακτηρισμός mAbs

14 Ανοσοφθορισμός σε κύτταρα HUVEC έναντι της VE- Cadherin. Ανοσοαποτύπωση κατά Western έναντι της VE- Cadherin σε HMEC ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ Χαρακτηρισμός μονοκλωνικών αντισωμάτων Αποτελέσματα I.Τα mAbs ανιχνεύουν τη VE-Cadherin και δεν παρατηρείται κάποια σταυρωτή αντίδραση (cross- reaction) με άλλες πρωτεΐνες. II.Τα mAbs αναγνωρίζουν και συνδέονται με τη VE-Cadherin στις διακυτταρικές συνδέσεις.

15 Ανίχνευση διαλυτής VE-Cadherin στην κυκλοφορία του αίματος σε ασθενείς από τη Μονάδα Εντατικής Θεραπείας ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ agarose mAbs Αποτέλεσμα Δυο διαλυτά τμήματα της VE- Cadherin με μοριακό βάρος ~85kDa και ~95kDa, αντίστοιχα. Αποτέλεσμα Δυο διαλυτά τμήματα της VE- Cadherin με μοριακό βάρος ~85kDa και ~95kDa, αντίστοιχα. Παρασκευή σφαιριδίων συγγένειας Ανοσοκατακρήμνιση έναντι της VE-Cadherin σε ορούς ασθενών της ΜΕΘ. Ομοιοπολική πρόσδεση mAbs σε σφαιρίδια συγγένειας Affigel-10

16 2.Ποσοτικοποίηση της διαλυτής VE-Cadherin που απελευθερώνεται στην κυκλοφορία του αίματος. Εγκαθίδρυση ELISA τύπου Sandwich Ορός ασθενών Βιοτινυλιωμένο mAb 2 mAb 1

17 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ 1.Έκφραση και απομόνωση εξωκυτταρικού τμήματος της VE-C (VEC-ex.D.). Άμεση ELISA ELISA τύπου Sandwich 2. Απομόνωση σε στήλη αγαρόζης Ni- IDA 1. Έκφραση σε μετασχηματισμένα βακτήρια BL-21

18 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ 2. Βιοτινυλίωση μονοκλωνικού αντισώματος 9G3. 200μg βιοτίνης ανά 1mg αντισώματος 9G3 Εγκαθίδρυση ELISA τύπου Sandwich Δημιουργία πρότυπης καμπύλης άμεσης ELISA Ευαισθησία άμεσης ELISA: 5ng/ml

19 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ 3. Δημιουργία πρότυπης καμπύλης Εγκαθίδρυση ELISA τύπου Sandwich Ευαισθησία δοκιμασίας Sandwich ELISA 2ng/ml Ευαισθησία δοκιμασίας Sandwich ELISA 2ng/ml διαλυτή VE-Cadherin σε υγιή άτομα 1-3 ng/ml (Soeki, Tamura et al. 2004);(Zhang, Liu et al.) διαλυτή VE-Cadherin σε υγιή άτομα 1-3 ng/ml (Soeki, Tamura et al. 2004);(Zhang, Liu et al.)

20 Διαγραμματική ανάλυση των ορών ασθενών από τη ΜΕΘ ύστερα από δοκιμασία ELISA τύπου Sandwich. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ Μέτρηση διαλυτής VE-Cadherin σε ασθενείς της Μονάδας Εντατικής Θεραπείας 8ng/ml  οξεία μυελογενής λευχαιμία- πνευμονία  ράγεν ανεύρυσμα αορτής  πνευμονία  ενδοκυψελιδική αιμορραγία  αγγειακό εγκεφαλικό- έμφραγμα του μυοκαρδίου 8ng/ml  οξεία μυελογενής λευχαιμία- πνευμονία  ράγεν ανεύρυσμα αορτής  πνευμονία  ενδοκυψελιδική αιμορραγία  αγγειακό εγκεφαλικό- έμφραγμα του μυοκαρδίου 32ng/ml, 45ng/ml  Σήψη 32ng/ml, 45ng/ml  Σήψη 9ng/ml  χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια 9ng/ml  χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια n=8 n=50 Μέσος Όρος= 2,75ng/ml

21 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ Μέτρηση διαλυτής VE-Cadherin σε ασθενείς της Μονάδας Εντατικής Θεραπείας Στάδιο 1 Πολυτραυματίες ΜΕΘ Στάδιο 2 Στάδιο 3 Δείγμα 10 ασθενών 8ng/ml 2ng/ml Ασθενής 1 Στάδιο 1 Στάδιο 2 Στάδιο 3 8ng/ml 2ng/ml Ασθενής 2 Αυξημένη διαλυτή VE-Cadherin στο στάδιο 1.

22 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ Συμπεράσματα I.Ανίχνευση δύο διαλυτών τμημάτων της VE-Cadherin (~85kDa και ~95kDa) στον ορό ασθενών της Μονάδας Εντατικής Θεραπείας. II.Εγκαθίδρυση ELISA τύπου Sandwich με ευαισθησία 2ng/ml. III.Ποσοτικοποίηση διαλυτής VE-Cadherin σε φυσιολογικά άτομα και σε ασθενείς της ΜΕΘ. IV.Αυξημένη συγκέντρωση διαλυτής VE-Cadherin στα πρώτα στάδια ανάπτυξης της ασθένειας. Δεν υπάρχει σαφής συσχέτιση των αυξημένων επιπέδων της sVEC με κάποια ασθένεια.

23 Γιάννης Παπάζογλου (ΒΕΤ – University Paris) Τάκης Καρράς (Μεταπτυχιακο Βιοτεχνολογιας – Cancer Institute Madrid) Συνεργάτες Σ. Χριστοφορίδης (Εργ. Βιολογικής Χημείας – Π. Ι) Γ. Νάκος (Κλινική Εντατικής Θεραπείας – Π.Ι) Ν. Μανιάτης (Κλινική Εντατικής Θεραπείας – Αττικό Νοσοκομείο και Ινστιτούτο Θώραξ)

24

25 Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ επίδραση θρομβίνης (3U/ml) σε HPMEC 20 min απενεργοποίηση της θρομβίνης Καλλιεργητικό μέσο κυτταρικά εκχυλίσματα 2mM EDTA 20 min Θρομβίνη Αποσταθεροποίηση των συνδέσμων προσκόλλησης και την αύξηση της ενδοθηλιακής διαπερατότητας (Ukropec, Hollinger et al. 2000).

26 Ανοσοαποτύπωση κατά Western έναντι της VE-Cadherin. α. ανοσοκατακρήμνιση σε καλλιεργητικό μέσο σε κύτταρα μάρτυρες HPME, β. ανοσοκατακρήμνιση σε καλλιεργητικό μέσο σε κύτταρα HPME ύστερα από επίδραση με θρομβίνη. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ Απελευθέρωση πρωτεολυτικών τμημάτων της VE-Cadherin ύστερα από επίδραση θρομβίνης σε ενδοθηλιακά κύτταρα Αποτέλεσμα ~65kDa NTF, ~65kDa Καλλιεργητικό μέσο

27 Ectodomain shedding 1. Προφλεγμονώδεις παράγοντες 2. Ενεργοποίηση ADAM 3. Shedding μορίων προσκόλλησης (VE-Cadherin) (Ponnuchamy and Khalil 2008)  Μορφογένεση  Διήθηση λευκοκυττάρων  Σηματοδότηση  Φλεγμονή  ασθένειες  Μορφογένεση  Διήθηση λευκοκυττάρων  Σηματοδότηση  Φλεγμονή  ασθένειες Πρωτεολυτική κατάτμηση-Βιολογικές διεργασίες 4. Διήθηση λευκοκυττάρων

28 Διακυτταρικοί σύνδεσμοι Υπερ-οικογένεια καδερινών Resink et al., 2009 Διαμεμβρανική πρωτεΐνη που σχηματίζει ομοτυπικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των εξωκυτταρικών περιοχών, παρουσία Ca +2. Αγγειακή Ενδοθηλιακή Καδερίνη

29 Διακυτταρικοί σύνδεσμοι Ενδοθηλιακοί σύνδεσμοι Dejana, E. 2004. Nat Rev Mol Cell Biol Adherens junctions participate in multiple functions, including establishment and maintenance of cell–cell adhesion, actin cytoskeleton remodeling, intracellular signaling, and transcriptional Regulation (harris nelson) Σύνδεσμοι προσκόλλησης (Adherens junctions) Είναι πολυπρωτεϊνικά σύμπλοκα, που διαμεσολαβούν στην ομοτυπική κυτταρική προσκόλληση και σχηματίζουν δομές που ομοιάζουν με φερμουάρ (zipper-like ).  Διατήρηση της ακεραιότητας του ιστού  Αναδιοργάνωση κυτταροσκελετού της ακτίνης  Σηματοδότηση  Διατήρηση της ακεραιότητας του ιστού  Αναδιοργάνωση κυτταροσκελετού της ακτίνης  Σηματοδότηση

30 Απελευθέρωση πρωτεολυτικών τμημάτων της VE-Cadherin ύστερα από επίδραση θρομβίνης σε ενδοθηλιακά κύτταρα ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ α. ανοσοαποτύπωμα κατά Western έναντι της VE-Cadherin ύστερα από επίδραση με θρομβίνη. β. ανοσοαποτύπωμα κατά Western έναντι της VE-Cadherin ύστερα από επίδραση με θρομβίνη σε διαφορετικά χρονικά διαστήματα. Αποτέλεσμα CTF-1, 35kDa Κυτταρικό εκχύλισμα

31 Ανίχνευση δεύτερου πρωτεολυτικού γεγονότος ύστερα από επίδραση με θρομβίνη ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ Δεύτερο γεγονός πρωτεολυτικής κατάτμησης της VE-Cadherin? (CTF-2, ~95kDa) Δεύτερο γεγονός πρωτεολυτικής κατάτμησης της VE-Cadherin? (CTF-2, ~95kDa) Ανοσοαποτύπωμα κατά Westerm Χρησιμοποιήθηκε πολυκλωνικό αντίσωμα για το κυτταροπλασματικό τμήμα της VE-Cadherin. Ανοσοαποτύπωμα κατά Western Το μονοκλωνικό αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε ήταν το 7F9. Αποτέλεσμα Ανοσοαποτύπωμα κατά Westerm έναντι της VE-Cadherin σε HPMEC ύστερα από επίδραση με θρομβίνη. Χρησιμοποιήθηκε το πολυκλωνικό αντίσωμα για το κυτταροπλασματικό τμήμα της VE-Cadherin σε SDS-PAGE χαμηλότερης συγκέντρωσης σε ακρυλαμίδιο (8%).

32 ~95kDa 135kDa γ-secretase ADAM10 ? α-cat p120 β-cat Κυτταρόπλασμα ~65kDa 35kDa Εξωκυτταρικός χώρος Πυρήνας ~35kDa ? ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ Συμπεράσματα III.Δεύτερο γεγονός πρωτεολυτικής κατάτμησης (95kDa) εξωτερικά του κυττάρου και πιθανώς ανάμεσα στην περιοχή EC1-EC2. Επίδραση θρομβίνης I.Απελευθέρωση διαλυτής VE-Cadherin (65kDa) στο καλλιεργητικό μέσο. II.Απελευθέρωση κυτταροπλασματικού τμήματος (35kDa) στο κυτταρικό εκχύλισμα.

33 Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ Η μελέτη των επιπέδων έκφρασης της VE-Cadherin και του VEGFR-2 σε ένα ζωικό μοντέλο πνευμονικής υπέρτασης. II. Σπάνια πνευμονική διαταραχή που χαρακτηρίζεται από αυξημένη αρτηριακή πίεση (>25mmHg) που οδηγεί σε καρδιακή ανεπάρκεια και αυξημένο ποσοστό θανάτου. Rabinovitch, 2008  Υπερτροφία ή/και υπερπλασία Αγγειακή αναδιαμόρφωση Vascular remodeling  Αυξημένη έκφραση MMPs Ενδοθηλιακά κύτταρα Ινοβλάστες Λεία Μυϊκά κύτταρα Εναπόθεση εξωκυττάριας ουσίας

34 μονοκροταλίνη Φυτοτοξίνη που προέρχεται από το φυτό Crotalaria spectabilis Πειραματικό μοντέλο Χορήγηση μονοκροταλίνης (60mg/kg) σε αρουραίους οδηγεί σε χαρακτηριστικά πνευμονικής υπέρτασης.  Ενδοθηλιακή βλάβη  Αυξημένη πνευμονική αρτηριακή πίεση  Φλεγμονή  Αγγειακή αναδιαμόρφωση  Ενδοθηλιακή βλάβη  Αυξημένη πνευμονική αρτηριακή πίεση  Φλεγμονή  Αγγειακή αναδιαμόρφωση ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ Πνευμονική υπέρταση  24 ώρες  15 η μέρα  35 η μέρα  24 ώρες  15 η μέρα  35 η μέρα Εκτομή πνευμόνων Ομογενοποίηση ιστών

35 Όλη η διαδικασία λαμβάνει χώρα στους 4 ο C. 1. Λυοφιλοποίηση πνεύμονα με την προσθήκη υγρού Ν2. 2. Προσθήκη διαλύματος λύσης 1% Triton-X100 στο λυοφιλοποιημένο πνεύμονα. 3. Επεξεργασία με υπερήχους, πλάτους 40%, χρονικού διαστήματος 10sec και 4 επαναλήψεις. 4. Φυγοκέντρηση στις 14800 rpm για 15 min. 5. Συλλογή υπερκείμενου, προσθήκη Laemmli και βράσιμο για 5min στους 95 ο C. 6. Ανοσοαποτύπωση κατά Western. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ Ομογενοποίηση ιστών από πνεύμονα αρουραίων που παρουσιάζουν πνευμονική υπέρταση

36 Πρωτεΐνη - στόχοςΚύτταραΠρωτεάση PECAM Ενδοθηλιακά, λεμφοκύτταρα, μονοκύτταρα, ουδετερόφιλα MMP/ADAM TNF-α Ενδοθηλιακά κύτταρα, λεμφοκύτταρα, μονοκύτταρα ADAM17/MMP7 VCAM-1Ενδοθηλιακά κύτταρα ADAM17 E-σελεκτίνη Ενδοθηλιακά κύτταρα άγνωστη L-σελεκτίνη λεμφοκύτταρα, μονοκύτταρα, ουδετερόφιλα ADAM17 Ectodomain shedding (Garton, Gough et al. 2006) Πρωτεολυτική κατάτμηση

37 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ Τα επίπεδα έκφρασης της VE-Cadherin αλλάζουν κατά τη διάρκεια ανάπτυξης πνευμονικής υπέρτασης σε πνεύμονες αρουραίων ύστερα από χορήγηση μονοκροταλίνης. Ανοσοαποτύπωμα κατά Western έναντι της VE-Cadherin και της a-τουμπουλίνης σε εκχυλίσματα ιστών από πνεύμονα αρουραίου ύστερα από επίδραση με μονοκροταλίνη. n=4 Διαγραμματική απεικόνιση της μεταβολής των επιπέδων έκφρασης της VE-Cadherin I.Τα επίπεδα της VE-Cadherin μειώνονται σε ποσοστό 49,5% 24 ώρες ύστερα από την χορήγηση μονοκροταλίνης. II.15 μέρες μετά, τα επίπεδα της VE-Cadherin παρουσιάζουν 35% μείωση. III.35 μέρες μετά, τα επίπεδα της VE-Cadherin διπλασιάζονται σε σχέση με αυτά στους πνεύμονες φυσιολογικών αρουραίων.

38 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ Τα επίπεδα έκφρασης του VEGFR-2 αλλάζουν κατά τη διάρκεια ανάπτυξης πνευμονικής υπέρτασης σε πνεύμονες αρουραίων ύστερα από χορήγηση μονοκροταλίνης. Ανοσοαποτύπωμα κατά Western έναντι του VEGFR-2 και της a-τουμπουλίνης. n=4 Αποτέλεσμα Διαγραμματική απεικόνιση της μεταβολής των επιπέδων έκφρασης του VEGFR-2 I.Ο VEGFR-2 μειώνεται σε ποσοστό 45% 24 ώρες ύστερα από την χορήγηση μονοκροταλίνης. II.Με τη συμπλήρωση 15 ημερών το ποσοστό μείωσης είναι περίπου 30%. III.35 μέρες μετά, τα επίπεδα έκφρασης του VEGFR-2 υπερδιπλασιάζονται σε σχέση με αυτά των φυσιολογικών αρουραίων.

39 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ Τα επίπεδα έκφρασης της καβεολίνης-1 αλλάζουν κατά τη διάρκεια ανάπτυξης πνευμονικής υπέρτασης σε πνεύμονες αρουραίων ύστερα από χορήγηση μονοκροταλίνης. Ανοσοαποτύπωμα κατά Western έναντι της καβεολίνης-1 και της a-τουμπουλίνης. n=4 Αποτέλεσμα Διαγραμματική απεικόνιση της μεταβολής των επιπέδων έκφρασης της καβεολίνης-1. I.Τα επίπεδα έκφρασης της καβεολίνης-1 μειώνονται σε ποσοστό 45% 24 ώρες ύστερα από τη χορήγηση της μονοκροταλίνης. II.Το ποσοστό μείωσης 15 μέρες μετά είναι περίπου 35% ενώ ύστερα από 35 μέρες η μείωση είναι περίπου 65%.

40 24 ώρες 15 μέρες 35 μέρες  VE-Cadherin (49,5%)  VEGFR-2 (45%)  VE-Cadherin (35%)  VEGFR-2 (30%)  VE-Cadherin (100%)  VEGFR-2 (200%) Χρόνος ύστερα από χορήγηση μονοκροταλίνης σε αρουραίους Επίπεδα έκφρασης ενδοθηλιακών δεικτών ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ  Τα επίπεδα έκφρασης της καβεολίνης-1 εμφανίζουν μείωση καθ’ όλη τη διάρκεια ανάπτυξης της ασθένειας. Μοντέλο πνευμονικής υπέρτασης με χορήγηση μονοκροταλίνης  Παράγοντες αγγειογένεσης (VEGF, VEGFR)  Κλωνογενής αύξηση  Ανθεκτικά στην απόπτωση  Μεταλλάξεις (TGF-β, Bax)  Παράγοντες αγγειογένεσης (VEGF, VEGFR)  Κλωνογενής αύξηση  Ανθεκτικά στην απόπτωση  Μεταλλάξεις (TGF-β, Bax) (Sakao et al., 2009)

41 ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ Ευχαριστίες κ. Κούκλη Αλεξάνδρα Βιολέττα Άρη Ελευθερία κ. Κούκλη Αλεξάνδρα Βιολέττα Άρη Ελευθερία Μέλη του εργαστηρίου Γενικής Βιολογίας Μέλη του Ινστιτούτου Βιοϊατρικών Ερευνών κ. Χριστοφορίδη Δημήτρη Μπασαγιάννη Μέλη του Ινστιτούτου Βιοϊατρικών Ερευνών κ. Χριστοφορίδη Δημήτρη Μπασαγιάννη Την οικογένειά μου ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ» Μέλη του εργαστηρίου Βιολογικής Χημείας κ. Φριλίγγος κ. Καρέτσου Μέλη του εργαστηρίου Βιολογικής Χημείας κ. Φριλίγγος κ. Καρέτσου

42 Μηχανισμός Πνευμονικής Υπέρτασης Πνευμονική Υπέρταση (Sakao, Tatsumi et al. 2009)

43 Ενδοθηλιακά κανάλια που υποστηρίζονται από ένα στρώμα μυοϊνοβλαστών και πρωτεϊνών της εξωκυττάριας ουσίας. Πνευμονική Υπέρταση Αγγειακή αναδιαμόρφωση «πλεξοειδείς βλάβες» (plexiform lesions) Rabinovitch, 2008 Γενικά χαρακτηριστικά της πνευμονικής υπέρτασης Sakao, Tatsumi, 2010

44 Πνευμονική Υπέρταση Πειραματικά μοντέλα πνευμονικής υπέρτασης

45 Potenta et al.,British Journal of Cancer (2008) 99, 1375 – 1379 Πνευμονική Υπέρταση Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT)

46 Πνευμονική Υπέρταση Πειραματικά μοντέλα πνευμονικής υπέρτασης