Αρχές Μεθόδων Μοριακής Βιολογίας

Παρουσίαση με θέμα: "Αρχές Μεθόδων Μοριακής Βιολογίας"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Αρχές Μεθόδων Μοριακής Βιολογίας
Βουλιάνα Βελετζά, Αναπλ. Καθηγήτρια Βιολογίας, Τμήμα Ιατρικής ΔΠΘ

2 Η Μοριακή Βιολογία, προϊόν της σύζευξης της Βιοχημείας με τη Γενετική παρέχει μια σειρά μεθόδων με ευρεία εφαρμογή σε όλες σχεδόν τις ιατρικές ειδικότητες και ιδιαίτερα στα λοιμώδη νοσήματα, τα κληρονομούμενα νοσήματα, τον καρκίνο κ.λ.π.

3 Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR)
Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης είναι μέθοδος παραγωγής μεγάλου αριθμού αντιγράφων συγκεκριμένων μικρών αλληλουχιών DNA – λογαριθμική αύξηση Βασίζεται στην ιδιότητα των αλυσίδων του DNA α) να αποχωρίζονται σε υψηλή θερμοκρασία και να επανενώνονται σε χαμηλότερη θερμοκρασία και β) να αντιγράφονται Παράγονται εκατομμύρια αντιγράφων

4 Εφαρμογές PCR Ανίχνευση DNA και RNA με τεράστια ευαισθησία  ανίχνευση ιών κ.α. μικροοργανισμών σε πολύ μικρές συγκεντρώσεις Ανίχνευση μεταλλάξεων

5 Κάθε τμήμα του DNA περιέχει δεδομένο αριθμό θέσεων περιορισμού που μπορεί να προσβληθούν από τα περιοριστικά ένζυμα Τμήματα DNA που έχουν τις ίδιες περιοριστικές θέσεις είναι ίδια ή ομόλογα

6 Sequence digested with: EcoNI
380bp 700bp

7 Sequence digested with: AciI, BfaI
730bp 350bp

8 Ανεύρεση πρωτοταγούς δομής DNA
Sanger ενζυμική μέθοδος ddntp dntp

9

10 Παραλλαγές PCR RT- PCR (reverse transcription PCR): για ενίσχυση RNA
Multiplex PCR Nested PCR Rep-PCR AFPL assay RAPD Real Time PCR επιτρέπει: - ποσοτική εκτίμηση ανατύπων σε αρχικό διάλυμα και - ποσοτικοποίηση διαφορών στην έκφραση mRNA

11 Multiplex PCR- ταυτόχρονη ενίσχυση πολλαπλών στόχων
Primer A/F-PrimerA/R Primer B/F-Primer B/R

12 Nested PCR A’ Pcr-736 bp 35 κύκλοι Nested Pcr-593 bp 35 κύκλοι
M.tubercolosis

13 RT-PCR. Συνδυασμός της αντίστροφης μεταγραφής και της PCR
Το αρχικό υλικό είναι mRNA. Χρησιµοποιείται για την παραγωγή αντιγράφων cDNA από mRNA. Στο πρώτο βήµα χρησιµοποιείται ανάστροφη µεταγραφάση (σύνθεση πρώτου κλώνου) Στο δεύτερο βήµα γίνεται σύνθεση του δεύτερου κλώνου.

14 RT-PCR •Ανίχνευση µεταλλάξεων χωρίς κλωνοποίηση του γονιδίου
•Κατασκευή βιβλιοθηκών cDNA(κυρίως όταν το αρχικό υλικό είναι πολύ σπάνιο) •Ανίχνευση µεταλλάξεων χωρίς κλωνοποίηση του γονιδίου •Ποσοτική µέτρηση της γονιδιακής έκφρασης Ενίσχυση επαναλαμβανομένων τμημάτων του γονιδιώματος του μικροβίου

15 AFPL assay amplified fragment length polymorphism
Ενίσχυση περιοχής Χ με την PCR Πέψη με ενδονουκλεάσεις περιορισμού Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης

16 RAPD Τυχαίοι primers 9-10 βάσεις Χαμηλή θερμοκρασία προσκόλλησης
Ο αριθμός και η θέση των τυχαίων περιοχών ενίσχυσης ποικίλουν σε διαφορετικά στελέχη του ίδιου είδους

17 PFGE Καλλιέργεια του μικροβίου στο ζωμό
Πέψη του γονιδιώματος με σπάνιες ενδονουκλεάσεις περιορισμού Ηλεκτροφόρηση σε παλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο

18 -

19 Real Time PCR Είναι η διαδικασία ενίσχυσης μιας DNA αλληλουχίας με τη μέθοδο της PCR και ταυτόχρονα της ανίχνευσης του παραγόμενου προϊόντος σε πραγματικό χρόνο καθ’ όλη τη διάρκεια της αντίδρασης (Real-time PCR).

20 Βασικά στοιχεία για την εκτέλεση της Real-time PCR
Ειδικές χρωστικές που ενσωματώνονται στο προϊόν της αντίδρασης και εκπέμπουν φθορίζον σήμα που ανιχνεύεται κατά τη διάρκεια της αντίδρασης. Ειδικά σχεδιασμένοι υποδοχείς δειγμάτων (τριχοειδή σωληνάρια) με άριστες οπτικές ιδιότητες για: τη διεξαγωγή της αντίδρασης και την ανίχνευση του εκπεμπόμενου σήματος Ταυτόχρονη ανίχνευση και ανάλυση των σημάτων φθορισμού από κάθε δείγμα.

21 Κινητική της αντίδρασης της PCR

22 SYBR Green l SYBR Green I Επανασύνδεση Τέλος επιμήκυνσης Αποδιάταξη
Επιμήκυνση Τέλος επιμήκυνσης SYBR Green I SYBR Gr SYBR Gr SYBR Gr SYBR Gr Transparency: Date: Authors: Comments: _____________________________________________________________________________________________

23 Σεσημασμένοι ανιχνευτές υβριδισμού (Hybridization Probes)
φλουορεσκίνη Μεταφορά ενέργειας (F.R.E.T.) αποδιάταξη επανασύνδεση επιμήκυνση τέλος επιμήκυνσης LC-640 Transparency: Date: Authors: Comments: _____________________________________________________________________________________________

24 Real-time PCR Υψηλή ταχύτητα εκτέλεσης της PCR
Παρακολούθηση της αντίδρασης σε πραγματικό χρόνο (On-line and Real-time Fluorescence Monitoring) Άμεσος χαρακτηρισμός προϊόντων με την ανάλυση του σημείου τήξης τους (Melting Curve Analysis) Ταχεία και ακριβής ποσοτικοποίηση Ελαχιστοποίηση κινδύνων επιμόλυνσης

25 Παρακολούθηση της PCR με τη χρήση SYBR Green I
Ανάλυση Transparency: Date: Authors: Comments: _____________________________________________________________________________________________ Quantification Melting Curve Template: human genomic DNA; Target: β-Globin; Detection Format: SYBR Green I

26 Real Time PCR

27 Inverse polymerase chain reaction is a variant of polymerase chain reaction (PCR) when only one internal sequence is known. This is especially useful in identifying flanking sequences to various genomic inserts. Like other polymerase chain reaction processes, inverse polymerase chain reaction is used to amplify DNA samples, via the temperature-mediated enzyme DNA polymerase. However, one of the key limitations of conventional polymerase chain reaction is that it requires primers complementary to the termini of the target DNA. This method allows PCR when only one internal sequence is known.

28 Multiplex-PCR: The use of multiple, unique primer sets within a single PCR reaction to produce amplicons of varying sizes specific to different DNA sequences. By targeting multiple genes at once, additional information may be gained from a single test run that otherwise would require several times the reagents and more time to perform. Annealing temperatures for each of the primer sets must be optimized to work correctly within a single reaction, and amplicon sizes, i.e., their base pair length, should be different enough to form distinct bands when visualized by gel electrophoresis. Nested PCR: increases the specificity of DNA amplification, by reducing background due to non-specific amplification of DNA. Two sets of primers are being used in two successive PCR reactions. In the first reaction, one pair of primers is used to generate DNA products, which besides the intended target, may still consist of non-specifically amplified DNA fragments. The product(s) are then used in a second PCR reaction with a set of primers whose binding sites are completely or partially different from and located 3' of each of the primers used in the first reaction. Nested PCR is often more successful in specifically amplifying long DNA fragments than conventional PCR, but it requires more detailed knowledge of the target sequences. Overlap-extension PCR: is a genetic engineering technique allowing the construction of a DNA sequence with an alteration inserted beyond the limit of the longest practical primer length.

29 TAIL-PCR: Thermal asymmetric interlaced PCR is used to isolate unknown sequence flanking a known sequence. Within the known sequence TAIL-PCR uses a nested pair of primers with differing annealing temperatures; a degenerate primer is used to amplify in the other direction from the unknown sequence.[24] Touchdown PCR: a variant of PCR that aims to reduce nonspecific background by gradually lowering the annealing temperature as PCR cycling progresses. The annealing temperature at the initial cycles is usually a few degrees (3-5˚C) above the Tm of the primers used, while at the later cycles, it is a few degrees (3-5˚C) below the primer Tm. The higher temperatures give greater specificity for primer binding, and the lower temperatures permit more efficient amplification from the specific products formed during the initial cycles.[25] PAN-AC: This method uses isothermal conditions for amplification, and may be used in living cells.[26][27]

30 Μέχρι πριν λίγα χρόνια οι Βιολόγοι μελετούσαν τα γονίδια και τις πρωτεΐνες κάθε ένα ξεχωριστά.
Στα γονίδια έγινε: Χαρτογράφηση Κλωνοποίηση & PCR Μεταλλαξογένεση Αλληλουχοποίηση Ανάλυση των πρωτεϊνών που κωδικοποιούν

31 Έτσι μελετήθηκαν πολλά γονίδια
Πρόγραμμα ανθρώπινου γονιδιώματος γονίδια Γονιδιώματα άλλων οργανισμών (E.coli, Drosophila,ποντικού κ.λ.π.) Για να γίνει εφικτή η εύρεση της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων ολόκληρων γονιδιωμάτων επιστρατεύθηκαν αυτοματοποιημένοι μηχανισμοί

32

33

34

35

36 Thale Cress, Arabidopsis thaliana
Rice, Oryza sativa Common Wheat, Triticum aestivum Maize, Zea mays Poplar, Populus trichocarpa (The first tree to have its genome fully sequenced) Escherichia coli, a coliform bacterium SARS virus Purple-spined sea urchin, Arbacia punctulata Caenorhabditis elegans, a nematode worm Zebra Danio, Brachydanio rerio African clawed frog, Xenopus laevis Oryzias latipes, a medakafish Tiger blowfish, Takifugu rubipres Tomato Solanum lycopersicum Potato Solanum tuberosum Western Honey bee, Apis mellifera Grapevine, Vitis vinifera L. Spanish flu Humans, Homo sapiens; see Human genome project Neanderthal, "Homo neanderthalensis" (partial) Haemophilus influenzae, a bacterium (the first free-living organism to have its genome fully sequenced) Common House Mouse, Mus musculus Brown Rat, Rattus norvegicus Common Chimpanzee Pan troglodytes; see Chimpanzee Genome Project Rhesus Macaque, Macaca mulatta Domestic Chicken, Gallus gallus Tammar Wallaby, Macropus eugenii Domestic Cat, Felis silvestris Domestic Dog, Canis lupus familiaris Common fruit fly, Drosophila melanogaster Baker's yeast, Saccharomyces cerevisiae Red bread mold, Neurospora crassa

37 Γνωρίζοντας την αλληλουχία νουκλεοτιδίων ολόκληρου του γονιδιώματος
Χρονοβόρα διαδικασία η μελέτη της λειτουργίας κάθε γονιδίου ξεχωριστά και ακόμη περισσότερο της αλληλεπίδρασης μεταξύ τους

38 Επιθυμητή η: - ταυτόχρονη μελέτη ΠΟΛΛΩΝ γονιδίων - ταυτόχρονη μελέτη ΟΛΩΝ των γονιδίων ενός οργανισμού

39 Genomics Συστηματική μελέτη του συνόλου του γενετικού υλικού ενός οργανισμού (δομή και λειτουργία) Εξετάζονται οι μοριακοί μηχανισμοί και η αλληλεπίδραση των γενετικών και περιβαλλοντικών παραμέτρων στις ασθένειες

40 Αν και κάθε κύτταρο ενός οργανισμού φέρει το ίδιο DNA…
Διαφορετικά γονίδια εκφράζονται σε κάθε διαφορετικό ιστό  διαφορετικά RNA Ποιοτική και ποσοτική διαφορά

41 Συγκρίνοντας το προφίλ γονιδιακής έκφρασης διαφορετικών κυττάρων μπορούμε να διακρίνουμε κατά πόσον αυτά διαφέρουν μεταξύ τους

42

43 Μικροσυστοιχίες (microarrays)
Υπόστρωμα: μεμβράνη ή γυαλί Προσδεδεμένα: ολιγονουκλεοτίδια ή cDNA Προστιθέμενο: cDNA μάρτυρα + cDNA δείγματος

44 Κάθε μικροσυστοιχία αποτελείται από χιλιάδες spots.
Κάθε spot περιέχει πολλαπλά αντίγραφα μιας μοναδικής αλληλουχίας DNA που αντιστοιχεί σε ένα γονίδιο (1 spot – 1 γονίδιο) Αν οι ανιχνευτές είναι cDNA: Ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης με μικροσυστοιχίες cDNA Μπορούμε να εντοπίσουμε διαφορές μεταξύ δύο ειδών κυττάρων, π.χ. καρκινικών κυττάρων vs.υγιών κυττάρων

45

46

47

48

49 Ανάλυση μικροσυστοιχιών
Ανάλυση μικροσυστοιχιών

50

51 Με τις μικροσυστοιχίες μπορούμε να εντοπίσουμε ποια γονίδια εκφράζονται διαφορετικά σε δύο είδη κυττάρων Δεν μπορούμε να εντοπίσουμε ποια γονίδια φέρουν μετάλλαξη η τι είδους βλάβη έχουν

52 Αριθμός αναφορών σε μικροσυστοιχίες DNA

53 SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms)

54

55 When DNA sequences on a part of chromosome 7 from two random individuals are compared, two single nucleotide polymorphisms (SNPs) occur in about 2,200 nucleotides.

56 The construction of the HapMap occurs in three steps
The construction of the HapMap occurs in three steps. (a) Single nucleotide polymorphisms(SNPs) are identified in DNA samples from multiple indivduals. (b)Adjacent SNPs that are inherited together are compiled into "haplotypes." (c)"Tag" SNPs within haplotypes are identified that uniquely identify those haplotypes. By genotyping the three tag SNPs shown in this figure, researchers can identify which of the four haplotypes shown here are present in each individual.

57 HapMap Παγκόσμιος οργανισμός με στόχο τη δημιουργία χάρτη που θα αντιπροσωπεύει τη διαφορετικότητα των ανθρωπίνων απλοτύπων. Ο χάρτης θα περιγράφει τις πλέον συνήθεις γενετικές παραλλαγές στο ανθρώπινο γονιδίωμα. Συνεργασία ερευνητών σε Πανεπιστήμια, μη κερδοσκοπικούς οργανισμούς και εταιρείες από Καναδά, Κίνα, Ιαπωνία, Νιγηρία, Μ.Βρεττανία και ΗΠΑ.

58 Proteomics Συστηματική μελέτη του συνόλου των πρωτεϊνών που παράγονται από ένα γονιδίωμα Ταυτοποίηση πρωτεϊνών και προσδιορισμός του ρόλου τους σε φυσιολογικές και σε παθοφυσιολογικές καταστάσεις

59 Στόχοι Πρωτεωμικής Ανάπτυξη προηγμένης αντικαρκινικής θεραπείας
Πρόγνωση της αποτελεσματικότητας εφαρμοζομένων θεραπειών Ανάπτυξη εξατομικευμένης θεραπείας

60 Εργαλεία πρωτεωμικής high-resolution mass spectrometry (MS): διαχωρίζει μεγάλο αριθμό πρωτεϊνών και πεπτιδίων ανάλογα με το μοριακό βάρος και το ηλεκτρικό φορτίο τους Μικροσκόπια με ικανότητα μικροχειρισμών και με τεχνολογία laser, παρέχουν τη δυνατότητα μελέτης του συνόλου των πρωτεϊνών ενός μοναδικού κυττάρου

61 …..omics Λειτουργική Γονιδιωματική (Functional genomics): χαρακτηρισμός των γονιδίων, των mRNA και των αντίστοιχων πρωτεϊνών Δομική Γονιδιωματική (Structural genomics): μελέτη των δομικών στοιχείων των γονιδίων και των χρωμοσωμάτων Συγκριτική Γονιδιωματική: Comparative genomics: -- the evolutionary relationships between the genes and proteins of different species.

62