Εργαστηριακή άσκηση 8: Ανοσοαποτύπωση

Παρουσίαση με θέμα: "Εργαστηριακή άσκηση 8: Ανοσοαποτύπωση"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Εργαστηριακή άσκηση 8: Ανοσοαποτύπωση
Εργαστήριο Ανοσολογίας Εαρινό εξάμηνο 2019 Υπεύθυνες Διδασκαλίας: Βογιατζάκη Χρυσάνθη, Τσουμάνη Μαρία

2 Αποτύπωση και στυπώματα
Συχνά απαιτείται η ανίχνευση µικρής ποσότητας πρωτεΐνης µέσα από ένα πλήθος άλλων πρωτεϊνών, όπως στην περίπτωση ύπαρξης κάποιας ιικής πρωτεΐνης στο αίµα. Η αποτύπωση είναι μια μέθοδος ανάλυσης βιομορίων (DNA, RNA ή πρωτεΐνες), κατά την οποία τα βιομόρια που έχουν διαχωρισθεί μετά από ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα μεταφέρονται σε μια σταθερή επιφάνεια, συνήθως μεμβράνη, δημιουργώντας έτσι ένα αποτύπωμα (ή στύπωμα, blot). Εναλλακτικά, τα δείγματα φέρονται απευθείας στη μεμβράνη, συνήθως νιτροκυτταρίνη ή PVDF(φθοριούχο πολυβινυλιδένιο) ή nylon membrane, με μορφή κηλίδων (dot blot), χωρίς να προηγηθεί ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός. Με τη μεταφορά τους στη μεμβράνη, τα μόρια ακινητοποιούνται και μπορούν να οπτικοποιηθούν με ειδικές τεχνικές χρώσης (π.χ. αργύρου για πρωτεΐνες), αυτοραδιογραφίας σημασμένων μορίων, ή με ειδική σήμανση πρωτεϊνών ή νουκλεϊκών οξέων. Η μέθοδος για την ανίχνευση ειδικών αλληλουχιών DNA είναι γνωστή ως αποτύπωση κατά Southern, για ανίχνευση μορίων RNA ως αποτύπωση κατά Northern, και για την ανίχνευση πρωτεϊνών ως αποτύπωση κατά Western.

3 Ανοσοαποτύπωση κηλίδας (Dot blot)
Η ανοσοαποτύπωση κηλίδας είναι μια μέθοδος ανίχνευσης, ανάλυσης και ταυτοποίησης πρωτεϊνών, ανάλογη της μεθόδου Western blot με τη διαφορά ότι τα δείγματα δε διαχωρίζονται με ηλεκτροφόρηση, αλλά εντοπίζονται μέσω κυκλικών προτύπων απευθείας πάνω στη μεμβράνη .

4 Ποσότητα από ακατέργαστα παρασκευάσματα οπως υπερκείμενο κυτταροκαλλιεργειών, εναιώρημα μεμβρανών κ.ά. (που πιθανόν περιέχει την προς ανίχνευση πρωτεϊνη/ες) εφαρμόζεται απευθείας πάνω στη μεμβράνη και προσροφάται σε αυτήν σχηματίζοντας μία κηλίδα. Αυτη η τεχνική μπορεί να χρησιμοποιηθεί είτε ως ποιοτική μέθοδος για την ταχεία διαλογή ενός μεγάλου αριθμού δειγμάτων είτε ως μια ποσοτική τεχνική. Είναι ιδιαίτερα χρήσιμο για τον έλεγχο της καταλληλότητας των πειραματικών παραμέτρων σχεδιασμού. Η συγκέντρωση των πρωτεϊνών μπορεί να εκτιμηθεί ημι-ποσοτικά εάν τοποθετηθει παράλληλα απομονωμένη πρωτεϊνη όσο και ειδικό αντίσωμα έναντι αυτής

5 Τα δείγματα πρωτεϊνών για την τιτλοδότηση αντισωμάτων θα πρέπει να περιέχουν την πρωτεΐνη που ενδιαφέρει σε υψηλή συγκέντρωση. Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη είναι ιδανική, ωστόσο μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν κυτταρολύματα cell lysates που περιέχουν υψηλά εκφρασμένη πρωτεΐνη. Πρέπει επίσης να συμπεριληφθούν δείγματα αρνητικού ελέγχου, ιδιαίτερα εάν χρησιμοποιούνται κυτταρολύματα. Τα αρνητικά δείγματα ελέγχου θα καθορίσουν εάν οποιοδήποτε παρατηρούμενο σήμα οφείλεται σε μη ειδική διασταυρούμενη αντιδραση (cross reaction)

6 blocking step Ένα πρόσθετο στάδιο της μεθόδου dot blot είναι το στάδιο της δέσμευσης των μη ειδικών θέσεων σύνδεσης των αντισωμάτων γνωστό ως blocking step . Πραγματοποιείται για να αυξήσει την ειδικότητα της τεχνικής κηλίδωσης Dot εμποδίζοντας τις μη ειδικές αλληλεπιδράσεις που οφείλονται στην σύνδεση των αντισωμάτων σε μη ειδικές πρωτεΐνες λόγω του φορτίου τους. Για να αποφευχθεί αυτό, η επιστρωμένη μεμβράνη επωάζεται με ένα διάλυμα πρωτεϊνών οι οποίες μπλοκάρουν τα φορτία που θα προσελκύσουν τα αντισώματα. Χρησιμοποιούνται διάφοροι παράγοντες δέσμευσης, συμπεριλαμβανομένων σκόνης ξηρού γάλακτος, αλβουμίνης ορού βοοειδών και καζεΐνης, ωστόσο σύγχρονοι παράγοντες αποκλεισμού χρησιμοποιούν συνθετικές ή /και ζωικές πρωτεϊνες για την πρόληψη οποιασδήποτε διασταυρούμενης αντίδρασης με τα υπο εξέταση αντισώματα

7 Χαρακτηριστικά της μεθόδου
Πλεονεκτήματα: Η τεχνική αυτή προσφέρει σημαντική οικονομία χρόνου, καθώς δεν απαιτούνται τα στάδια της ηλεκτροφόρησης και της μεταφοράς. Η μέθοδος είναι κατάλληλη για να επιβεβαιωθεί ή όχι η παρουσία μιας πρωτεΐνης σε ένα μείγμα πρωτεϊνών, για την εκτίμηση της συγκέντρωσης πρωτεΐνης σε ακατέργαστα παρασκευάσματα όπως υπερκείμενο καλλιέργειας ιστού ή ασκίτη, για να προσδιοριστεί εάν ένα σύστημα ανίχνευσης βασισμένο σε αντίσωμα θα λειτουργήσει αποτελεσματικά ή για να προσδιορίσει μια κατάλληλη συγκέντρωση αντισώματος για κηλίδωση Western.

8 Χαρακτηριστικά της μεθόδου
Μειονεκτήματα: Λόγω της έλλειψης του σταδίου διαχωρισμού πρωτεϊνών, η αποτύπωση κηλίδας δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για : τον προσδιορισμό του μοριακού βάρους μιας πρωτεΐνης ή για τη διάκριση μεταξύ διαφορετικών πρωτεϊνικών μορφών (π.χ. διασπασμένων ή φωσφορυλιωμένων πρωτεϊνών). Η τεχνική δεν δίνει καμία πληροφορία για τα μεγέθη των μορίων, τις διαφορετικές ισομορφές κλπ, καθώς όλα βρίσκονται και σημαίνονται στην ίδια κηλίδα.

9 Χαρακτηριστικά της μεθόδου
Πλεονεκτήματα: Αντιθέτως, η μέθοδος είναι κατάλληλη για : την εκτίμηση της συγκέντρωσης πρωτεΐνης σε ακατέργαστα παρασκευάσματα όπως υπερκείμενο καλλιέργειας ιστού ή ασκίτη, να προσδιοριστεί εάν ένα σύστημα ανίχνευσης βασισμένο σε αντίσωμα θα λειτουργήσει αποτελεσματικά ή να προσδιορίσει μια κατάλληλη συγκέντρωση αντισώματος για κηλίδωση Western.

10 Ανοσολογικές τεχνικές για έλεγχο αυτοαντισωμάτων
Έμμεσος ανοσοφθορισμός Ραδιοανοσοανάλυση (RIA) Ενζυμική ανοσοδοκιμασία (ELISA, western ή dot blotting) H ENA (Extrctable Nuclear Antigen, ENA) dot τεχνική είναι μια ευαίσθητη ανοσολογική μέθοδος, συμπληρωματική του ανοσοφθορισμού, για τον προσδιορισμό των αντισωμάτων Sm, Sm/RNP, SS-A, SS-B, Jo-1 και Scl-70 σε ανθρώπινο ορό ή πλάσμα. Τα αντισώματα έναντι των εκχυλίσιμων πυρηνικών αντιγόνων ή αντι-ENA, χρησιμοποιούνται στη διάγνωση του συστηματικού ερυθηματώδη λύκου (ΣΕΛ) και της μικτής νόσου του συνδετικού ιστού και για τον αποκλεισμό άλλων αυτοάνοσων νοσημάτων. Τα αντι-ΕΝΑ είναι ένα είδος αντιπυρηνικών αντισωμάτων έναντι ορισμένων αντιγόνων του πυρήνα που αποτελούνται από RNA και πρωτεΐνες. Τα πιο κοινά ΕΝΑ αντιγόνα είναι το Smith (SM) και η ριβονουκλεοπρωτεΐνη (RNP). Στα ΕΝΑ αντιγόνα περιλαμβάνονται ακόμη τα SSΑ/Ro, SSΒ/La, Jo-1 και Scl-70.

11 Τα αντιπυρηνικά Smith (αντι-Smith, αντι-SM)
Τα αντιπυρηνικά αντισώματα έναντι της ριβονουκλεοπρωτεΐνης (αντι-RNP) Αντισώματα έναντι της ιστυδυλικής tRNA συνθετάσης (Αντι-Jo-1) Τα αντισώματα αντι-SSΑ/Ro και αντι-SSΒ/La α αντισώματα σκληροδερμίας (αντι-Scl-70) Ανιχνεύονται περίπου στο 30% περίπου των ασθενών με συστηματικό ερυθηματώδη λύκο και στο 8% των ασθενών με μικτή νόσου του συνδετικού ιστού. Δεν ανιχνεύονται σε ασθενείς με άλλα νοσήματα του κολλαγόνου. ανιχνεύονται σχεδόν στο 100% των περιστατικών μικτής νόσου του συνδετικού ιστού και περίπου στο 25% των περιστατικών με συστηματικό ερυθηματώδη λύκο, με δισκοειδή λύκο και προοδευτική συστηματική σκλήρυνση (σκληρόδερμα). Υψηλοί τίτλοι αντι-RNP υποδεικνύουν μικτή νόσο του συνδετικού ιστού. Ανιχνεύονται σε αυτοάνοση διάμεση πνευμονική ίνωση και σε λίγους ασθενείς με αυτοάνοση μυοσίτιδα. Ανιχνεύονται και αξιολογούνται κυρίως στην διαγνωστική αξιολόγηση του συνδρόμου Sjögren*. *συστηματική αυτοάνοση πάθηση, που προσβάλλει κατ’ εξοχήν τους εξωκρινείς αδένες και προπαντός τους δακρυϊκούς και σιελογόνους. Ανιχνεύονται σε ασθενείς με σκληροδερμία και σύνδρομο CREST* *Calcinosis, Raynaud’s phenomena, Esophageal dysmobility, Sclerodaktyly και Telangiectasias. Η μικτή νόσος του συνδετικού ιστού (Mixed Connective Tissue Disease; MCTD) είναι ένα ξεχωριστό αυτοάνοσο νόσημα, χαρακτηριζόμενο από εκδηλώσεις προοδευτικής συστηματικής σκληροδερμίας, συστηματικού ερυθηματώδους λύκου και δερματομυοσίτιδας, σε συνδυασμό με υψηλούς τίτ­λους αντι-ΕΝΑ αντισωμάτων (U1- ριβονουκλεοπρωτεΐνη; RNP).Αλλοι το χαρακτηρίζουν ως αδιαφοροποίητο νόσημα του συνδετικού ιστού ή σύνδρομο επικάλυψης, στο οποίο περιλαμβάνονται εκδηλώσεις ΣΕΛ, προοδευτικής συστηματικής σκλήρυνσης, ρευματοειδούς αρθρίτιδας και μυοσίτιδας, χωρίς όμως ιδιαίτερη ονομασία.

12 Αρχή της μεθόδου Ο ορός των ασθενών και οι λωρίδες (strips) επωάζονται στον ειδικό δίσκο δοκιμής. Κατά την επώαση τα αντισώματα του ασθενούς προσδένονται στα αυτοαντιγόνα που είναι ακινητοποιημένα στις λωρίδες. Στη συνέχεια απομακρύνονται τα αντισώματα που δεν έχουν προσδεθεί με διάλυμα έκπλυσης Τα προσδεδεμένα αντισώματα αντιδρούν ειδικά με το αντι-ανθρώπινο IgG αντισώμα συζευγμένο με το ένζυμο αλκαλική φωσφατάση. Στη συνέχεια απομακρύνεται η περίσσεια τoυ δευτερογενούς αντισώματος Η αλκαλική φωσφατάση μετατρέπει το άχρωμο υπόστρωμα ΝΒΤ (nitro blue tetrazolium) συζευγμένο με BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate) σε κηλίδα με σκούρο μωβ χρώμα Κάθε strip έχει 6 κουκίδες στις οποίες έχουν προσροφηθεί τα εξής αντιγόνα: Sm, Sm/RNP, SS-A, SS-B, Jo-1 και Scl-70. Δύο ακόμη κηλίδες χρησιμεύουν σαν θετικό και αρνητικό control.

13 Αντιδραστήρια που περιέχονται
Dot strips Διάλυμα έκπλυσης 10x Αραιωτικό μέσο (κίτρινο χρώμα) Δευτερογενές αντίσωμα, anti-human IgG (goat) coupled with alkaline phosphate (κόκκινο χρώμα) Υπόστρωμα, nitroblue tetrazolium with bromo-chloro-indolyl-phosphate Δίσκος επώασης

14 Πειραματική διαδικασία
Προετοιμασία αντιδραστηρίων:Αραιώνεται το διάλυμα έκπλυσης από 10x σε 1x Όλα τα αντιδραστήρια αφήνονται σε θερμοκρασία δωματίου (18-25 οC). Πριν από κάθε χρήση, αναδεύονται απαλά χωρίς να δημιουργείται αφρός Οι λωρίδες ξεπλένονται με 2 ml διάλυμα έκπλυσης για 10 min σε RT ενώ αναδεύονται Το διάλυμα έκπλυσης απορρίπτεται Στη συνέχεια, προστίθεται 1,5 ml αραιωτικό μέσο και 10 μl ορός Επώαση για 30 min, RT, υπό ανάδευση Οι λωρίδες ξεπλένονται τρεις φορές για τρία λεπτά τη φορά με 1,5 ml διάλυμα έκπλυσης υπό ανάδευση Προστίθεται1,5 ml δευτερογενούς αντισώματος Προστίθεται 1,5 ml υποστρώματος Επώαση για min υπό ανάδευση Γίνεται αναρρόφηση και στη συνέχεια προστίθεται διάλυμα έκπλυσης για 3 λεπτά υπό ανάδευση για να σταματήσει η αντίδραση Συλλέγονται οι λωρίδες και αφήνονται να στεγνώσουν για τουλάχιστον 30 λεπτά

15 Αξιολόγηση αποτελεσμάτων
Αρνητικό control Θετικό αποτέλεσμα. Ο ασθενής έχει τα αντιγόνα Sm και SSA.