DNA – polymér zložený z opakujúcich sa jednotiek

Παρουσίαση με θέμα: "DNA – polymér zložený z opakujúcich sa jednotiek"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 DNA – polymér zložený z opakujúcich sa jednotiek
NUKLEOTID Základná stavebná jednotka DNA

2 Nukleotid: Dusíková báza – purín (adenín a guanín) – pyrimidín(cytozín a tymín – v DNA, uracil (namiesto tymínu – v RNA) Cukor - (päťuhlíkový cukor) v DNA - 2 deoxyribóza v RNA - ribóza 3. Fosfátový zvyšok - H3PO4

3 Dusíková báza V DNA sú : A, T, G a C V RNA sú : A, U, G a C

4 Cukor v RNA – D ribóza v DNA - 2 deoxy D ribóza

5

6 KOMPLEMENTARITA BÁZ

7 KOMPLEMENTARITA BÁZ

8 Reťazce DNA sú antiparalelné
Polarita voľné 5’-PO42- 3’-OH konce Antiparalelizmus DNA 5´-koniec ´-koniec 3´-koniec ´-koniec :::::: =deoxyribóza =fosfodieste- rová väzba malý žliabok veľký

9 D N A Kódujúce vlákno (sense strand) 5´ 3´ 5´ 3´ Komplementárne vlákno (template strand)

10 Dvojzávitnica DNA

11 Pravo a ľavo - točivá DNA

12

13 B Z

14 Rôzne formy DNA

15 Úlohy DNA Schopnosť zachovať genetickú informáciu
Odovzdať genetickú informáciu potomstvu (dcérske bunky) Vytvárať kópie – replikácia Schopnosť mutovať – evolúcia Realizuje sa genetická informácia - proteosyntéza

16 REPLIKÁCIA DNA Zdvojenie DNA
Prenos genetickej informácie z rodičovských organizmov na potomstvo Vzhľadom na dĺžku DNA v bunke trvá niekoľko hodín ( živočíšna DNA sa zreplikuje asi za 8 hod s 2 chybami) Uskutočňuje na približne 400 miestach v jadre naraz

17 Semikonzervatívna = semidiskontinuálna
materské reťazce dcérske reťazce ku každému z pôvodných vlákien DNA sa nasyntetizuje nové vlákno

18 Tvorba nového reťazca podľa pravidiel komplementarity
C-G A-T

19 Fázy replikácie Iniciácia - začatie Elongácia - predlžovanie Terminácia - ukončenie

20 Topoizomeráza

21 helikázy – rozpletenie reťazcov

22 ssb proteíny – udržujú DNA v jednovláknovom stave
3' 5' dsDNA-binding proteins ssDNA- binding protein(s)

23 Iniciácia, začína v bode ORI
U človeka je asi miest dna A, B, C proteíny

24

25 Replikačná vidlica

26 Smer pohybu v replikačnej bubline

27 DNA polymeráza hlavný enzým zodpovedný za predlžovanie reťazca DNA
chybovosť 1 / 107

28 Polymeráza má aj exonukleázovú aktivitu

29

30 DIMÉR Katalytické jadro polymerázy α + ε + θ β svorka- posúva sa za katalytickým jadrom a drží pohromade materský a dcérsky reťazec (sama sa nenapojí) γ komplex - nakladá β svorky na DNA v mieste, kde sú RNA primery

31 Orientácia DNA reťazcov
vedúce vlákno oneskorené (zaostávajúce)vlákno

32 Primozóm = dna A,B,C proteíny + RNA primáza (tvorí primer)
komplex 6 proteínov potrebných pre syntézu primeru (3-6 nukleotidov) na 5´konci DNA vlákna Primáza - robí chyby, nemá exonukleázovú aktivitu (nevadí)

33 DNA ligáza – spájanie reťazcov

34 Iniciácia RNA primer

35 Elongácia DNA Polymeráza III

36 Iniciácia a funkčné elementy potrebné pre začatie
replikácie eukaryotickej DNA ORC ORC - origin recognition complex ORC

37 Prebieha v telomérach, za pomoci TELOMERÁZY
Doreplikovanie medzery = dokončenie syntézy dcérskych reťazcov Prebieha v telomérach, za pomoci TELOMERÁZY

38

39 GÉN základná funkčná genetická jednotka
Gén predstavuje kompletnú sekvenciu nukleovej kyseliny (DNA alebo RNA), ktorá nesie informáciu pre syntézu určitého produktu (funkčnej RNA alebo proteínu). 1. Gén pre funkčnú RNA – DNA úseky - kódujú primárnu štruktúru rRNA a tRNA 2. Gén ako regulačná oblasť – úsek DNA alebo RNA (u RNA vírusov) – plní regulačnú funkciu. – rozpoznávaný špecif. proteínom – napojenie signalizuje zahájenie alebo zastavenie transkripcie – gén nemá produkt 3. Štruktúrny gén - úsek DNA – obsahuje informáciu o  primárnej štruktúre proteínu

40 Centrálna dogma molekulovej biológie
transkripcia translácia DNA ⇨ RNA ⇨ protein Watson a Crick 1959

41

42

43 Pozmenenie centrálnej dogmy molekulovej biológie
Temin a Baltimore 1973 Reverzná transkriptáza

44 TRANSKRIPCIA Prepis genetickej informácie z DNA do mRNA
Prebieha v jadre

45 Prokaryoty majú len jeden druh RNA-polymerázy, ktorá katalyzuje syntézu RNA zo všetkých génov.
Eukaryoty naopak používajú viacero typov RNA-polymeráz, ktoré zabezpečujú transkripciu z rôznych génových skupín.

46 Iniciácia Promótor rozpozná σ-faktor
proteínová podjednotka RNA-polymerázy polymeráza začne odvíjať DNA - TATA box

47 Elongácia Transkripcia začína štartovacím kodónom ATG
označuje sa +1. Pozícia na sekvencii DNA, ktorý sa nachádza pred týmto nukleotidom, má záporné číslovanie, 0 neexistuje Vytvára sa dočasný hybrid DNA - RNA RNA sa oddeľuje od DNA

48 terminácia rho nezávislá rho závislá

49 Iniciácia transkripcie eukaryotických génov
RNA polymeráza II potrebuje transkripčné faktory (evolučne konzervované), aby dokázala nasadnúť na promótor

50 Iniciácia transkripcie

51 hnRNA ⇨mRNA Vytvorenie čiapočky (cap) Posttranskripčná úprava
pred 5' UTR oblasť pripojí 5'-5' väzbou guanozín chráni molekulu z tejto strany uľahčuje jej naviazanie na ribozóm.

52 2. Vyštiepenie intrónov (splicing)
Enzymaticky sa vystrihnú kópie intrónov a ligázou sa pospájajú exóny.

53 Splicing eukaryotického génu

54 Malé RNA človeka Druh malej RNA výskyt funkcia syntetizujúci enzým
U1 snRNA jadro riadenie zostrihu RNA polymeráza II U2 snRNA jadro riadenie zostrihu RNA polymeráza II U4 snRNA jadro riadenie zostrihu RNA polymeráza II U5 snRNA jadro riadenie zostrihu RNA polymeráza II U6 snRNA jadro riadenie zostrihu RNA polymeráza III U7 snRNA jadro riadenie zostrihu RNA polymeráza II histónovej hnRNA U11 snRNA jadro riadenie zostrihu RNA polymeráza II U12 snRNA jadro riadenie zostrihu RNA polymeráza II 7SK snRNA jadro neznáma RNA polymeráza III 8-2 snRNA jadro úprava pre-tRNA RNA polymeráza III U3 snoRNA jadierko úprava pre-tRNA RNA polymeráza II U8 snoRNA jadierko úprava pre-rRNA RNA polymeráza II U13 snoRNA jadierko neznáma RNA polymeráza II 7SI scRNA cytoplazma translokácia proteínov RNA polymeráza III

55 3. Tvorba chvostíka ( 3' koniec)
poly(A)polymeráza za 3' UTR nasyntetizuje 250 adenínov medzi každý 10 adenín sa včlení bielkovina mRNA pre históny nemá polyA chvost Funkcia: stabilizácia ochrana 3´ pred účinkom degradačných enzýmov

56 TRANSLÁCIA Preklad genetickej informácie z mRNA do poradia AK
Prebieha v cytoplazme na ribozómoch

57 16 S rRNA

58 rRNA sa syntetizuje v jadierku - RNA polymeráza I.
NOR – oblasť organizácie jadierka Gény pre rRNA – akrocentr. chromoz. D a G v oblasti satelitov Prekurzorová rRNA S + metylácia + bielkoviny = stabilita 45 S ⇨ 28S , 18 S a 5,8 S rRNA Prechádzajú cez jadrové póry (20nm) 5,8 S 5 min 28 S min

59 5S rRNA - RNA polymeráza III.
Small RNA genes 5S rRNA - RNA polymeráza III.

60 akceptorové rameno (bez slučky) - na jeho koniec sa viaže aminokyselina
antikodónové rameno s antikodónovou slučkou - týmto koncom tRNA rozoznáva genetický kód zapísaný v mRNA pseudouridínové rameno s TΨC-slučkou - obsahuje modifikovaný uracil - pseudouracil dihydrouridínové rameno s D-slučkou- obsahuje modifikovaný uracil - dihydrouracil variabilná slučka - môže byť krátka alebo dlhá neovplyvňuje biologickú funkciu tRNA

61 typ polymerázy výskyt funkcia
RNA-polymeráza I jadierko transkribuje gény pre rRNA RNA-polymeráza II jadro transkribuje štruktúrne gény a gény pre niektoré malé RNA RNA-polymeráza III jadro transkribuje gény pre tRNA, S-rRNA a niektoré malé RNA

62 Fázy translácie Aktivácia aminokyselín – AK+tRNA Iniciácia Elongácia Terminácia

63 prediniciačný komplex
Met tRNA translačný komplex ternárny komplex prediniciačný komplex iniciačný komplex

64 Miesta na ribozóme A – aminokyselinové AK + tRNA P – peptidové peptidyltransferáza E - odchod bielkovín R - odchod tRNA

65 Terminácia Prok. termináciu riadia terminačné faktory RF1 až RF3.
U eukar je uvoľňovací faktor eRF rozpozná jeden zo STOP kodónov a uvoľní polypeptidový reťazec

66 Prokaryotická Eukaryotická proteosyntéza
Jadrová membrána Neprítomná Prítomná Promótor GACA box (-35) TATA box (Pribnowov box) (-10) GC-box (-90) CAAT-box (-80) TATA-box (Hognessov box) (-35) RNA polymeráza Jedna I. – III. Translácia iniciovaná Shine-Dalgarnov box 5’ cap Prvý kodón fMet Met Polycistronická (viac génov) Monocistronická (jeden gén) Gén 1 Gén 2 Gén 3 dlhá mRNA Gén mRNA

67 Spôsoby získavania biologického materiálu
venepunkcia biopsia nekropsia stery filtrácia

68 SKLADOVANIE BIOLOGICKÉHO MATERIÁLU
USKLADNENIE - krátkodobé (chladničky a mrazničky) suspenzné bakteriálne kultúry, bakt. na platni, tkanivové kultúry, vysušená DNA ZÁLOHOVANIE - zlyhanie analýzy (mrazničky – 20 oC) tkanivá, rozpustená DNA , enzýmy ARCHIVÁCIA (hĺbkové mrazničky – 80 oC, paraf. bločky tekutý dusík – 160 oC ) - súdne lekárstvo - retrospektívna analýza - nové diagnostické metódy

69 HOMOGENIZÁCIA 1. mechanická 2. fyzikálna 3. chemická ‑ trecie misky
‑ homogenizátor ‑ pretlačenie cez otvor 2. fyzikálna  ‑ ultrasonikácia ‑ zmrazovanie a rozmrazovanie ‑ hypotonizácia 3. chemická   ‑ detergenty ‑ enzymatické natrávenie

70 GAATTC CTTAAG Restrikčné enzýmy Restrikčné endonukleázy, restriktázy
Rozpoznávajú PALINDRÓM GAATTC CTTAAG 5’  3’ 3’  5’ štiepia špecificky 2 vláknovú DNA

71

72 Štiepenie DNA restrikčnými enzýmami
TUPÉ KONCE LEPIVÉ KONCE

73

74 Gél po ukončení elektroforézy
Gélová elektroforéza Rýchlosť pohybu molekúl závisí od: Rozmerov molekúl DNA Zmes DNA molekúl rozličných veľkostí Zdroj prúdu Gél Sklené platne Dlhšie molekuly Kratšie Gél po ukončení elektroforézy

75 Rýchlosť pohybu molekúl závisí od:
Koncentrácie gélu Konformácie DNA Veľkosti elektrického napätia Zloženia roztokov Teploty

76 Elektroforetická kontrola dobre vyizolovanej DNA

77 po dokončení elfo sa veľkosti fragmentov DNA stanovujú pomocou fragmentov známej dĺžky - veľkostných štandardov

78 METÓDY MOLEKULOVEJ BIOLÓGIE
A ICH VYUŽITIE PCR VNTR Sekvenovanie RFLP Fingerprint FISH

79 Polymerázová reťazová reakcia PCR skúmavky Teplotný cyklovač
Na uskutočnenie PCR je treba mať: PCR skúmavky Teplotný cyklovač Reakčná zmes templátová DNA PCR primery dNTP Taq polymeráza (150 nukl./s) reakčný roztok

80 C Y K L U S 1. Denaturácia teplom ( 94-96ºC)
2. Naviazanie primerov (50-65ºC) 3. Syntéza DNA ( 70-72ºC) 4. Postup sa opakuje po 30 cykloch vzniká viac ako milión kópií

81 VNTR - (variabilný počet tandemových opakovaní)
pomocou PCR ATTGGA- motív dĺžka úseku DNA „alela“ príslušného VNTR systému

82 Alely sa prenášajú z rodičov na deti (1 alela od otca a 1 od matky)

83 STR - Short Tandem Repeat
Používa sa od 90 tych rokov vo foréznej medicíne. Metóda využíva variabilitu pri opakovaní krátkých sekvencií nukleotidov v určitých úsekoch DNA. Metóda STR polymorfizmov Aby bola dosiahnutá vysoká rozlišovacia schopnosť, je vyšetrovaných viacej STR polymorfizmov zároveň.

84 Sekvenovanie DNA - určenie presného poradia nukleotidov v DNA
1. Sangerova metóda (r. 1975) 2. Maxamova-Gilbertova metóda (r. 1977) 3. Automatické sekvenátory (r. 1995)

85 Sangerova metóda sekvenovania
Princípom - klasická PCR Ale! - pri syntéze dôjde k náhodnému zastaveniu dideoxyribonukleozidtrifosfáty – ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP nemôže naviazať ďalší deoxyribonukleotid vznikajú tak nedokončené úseky s rôznou dĺžkou - oddelenie pomocou elektroforézy

86 Fluorescenčná in situ hybridizácia

87 Typy sond pre FISH: 1. Centromerické

88 2. Génové (lokusovo špecifické)

89 3. Celochromozómové („paintingové“)

90 typy polymorfizmu DNA bodový polymorfizmus hypervariabilné oblasti DNA
typy polymorfizmu DNA - majú odlišný molekulový základ bodový polymorfizmus (RFLP, Sekvenovanie) hypervariabilné oblasti DNA (RFLP, Fingerprint, VNTR, STR)

91 Polymorfizmus dĺžky restrikčných fragmentov
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

92 1. izolácia DNA

93 2. štiepenie DNA jedným restrikčným enzýmom

94 3. Rozdelenie DNA fragmentov v elektroforéze
Fragmenty v géli sú stále dvojvláknové

95 4. Denaturácia DNA fragmentov
Chemická denaturácia - pH 12 5. Neutralizácia Fragmenty zostanú jednovláknové 6. Southernov blotting Prenos fragmentov DNA z gélu na membránu (nylonová, nitrocelulózová) – kapilárna elevácia

96 6. Southernov blotting

97 7. Fixácia DNA v membráne 8. Príprava sondy
Vákuová sušička 2 hod. pri 80 oC 8. Príprava sondy Jednovláknový úsek DNA - rádioaktívne značená

98 9. Hybridizácia DNA zo spermií lososa

99 10. Autorádiografia a vyvolanie RTG filmu
11. Vyhodnotenie výsledkov

100 Kosáčiková anémia 146 AK v β-globínovom reťazci hemoglobínu
substitučná mutácia – zámena adenínu za tymín v 6. AK: A : CCT GAG GAG Pro Glu Glu S : CCT GTG GAG Pro Val Glu

101 Kosáčiková anémia metódou RFLP
A S

102 Fingerprint Prof. Alec Jeffreys

103

104 Prípad 1 Prípad 2

105 Možnosti využitia Diagnostika genetických (monogénnych aj multifaktoriálnych) a nádorových ochorení Génová terapia (genetických a nádorových ochorení) Cielená liečba („molekulárna farmakológia“) Štúdium biologických funkcií na molekulárnej úrovni (diferenciácia, starnutie ...) Evolúcia človeka a pôvod ľudských populácií Podstatný krok - poznanie biológie nášho druhu!