Παναγιώτης Χερουβείμ ΑΜ: 5327 Ακαδ. έτος: Μάθημα: Μοριακές ασθένειες

Παρουσίαση με θέμα: "Παναγιώτης Χερουβείμ ΑΜ: 5327 Ακαδ. έτος: Μάθημα: Μοριακές ασθένειες"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Γλυκόλυση εντός του κυστιδίου παρέχει ενέργεια on-board για ταχεία αξονική μεταφορά
Παναγιώτης Χερουβείμ ΑΜ: 5327 Ακαδ. έτος: Μάθημα: Μοριακές ασθένειες Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων Σχολή Επιστημών Υγείας Τμήμα Ιατρικής

2 Ταχεία αξονική μεταφορά (Fast axonal transport/FAT)
Η ταχεία αξονική μεταφορά (FAT) διαμεσολαβείται από μοριακές μηχανές κινεσίνης και δινεϊνης που μεταφέρουν φορτία σε μεγάλες αποστάσεις στους νευρώνες (μέχρι και 1m απόσταση απο το κυτταρικό σωμα) Για την μεταφορά αυτή απαιτείται ενέργεια υπο την μορφή ATP, η οποία πρέπει να παρέχεται συνεχώς σε αυτές τις μηχανές σε όλο το μήκος του νευράξονα

3 Ενέργεια για ταχεία αξονική μεταφορά
Η γλυκόζη είναι η κύρια πηγή ενέργειας του εγκεφάλου Η γλυκόλυση γίνεται στο κυττοσόλιο παράγοντας πυροσταφιλικό το οποίο μέσω του κύκλου του Krebs και της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης παράγει ATP στα μιτοχόνδρια Ωστόσο δεν παρατηρούνται πολλά μιτοχόνδρια στους κόμβους Ravier και στις συνάψεις όπου είναι απαραίτητα μεγάλα ποσά ενέργειας, το ερώτημα λοιπόν είναι πώς παροχετεύεται συνεχώς ενέργεια σε αυτές τις περιοχές καθώς και για την ταχεία αξονική μεταφορά?

4 GAPDH Το GADPH (γλυκεραλδεϋδη-3-φωσφορική διϋδρογονάση) είναι ένα ένζυμο που καταλύει το 6ο βήμα της γλυκόλυσης (μετατροπή 3-Ρ-γλυκεραλδεϋδης σε 1.3-ΒΡ-γλυκεραλδεϋδη)

5 Συνεισφορά μιτοχονδρίων και GAPDH στην ταχεία αξονική μεταφορά
Έγινε μελέτη μέσω αναστολής της μιτοχονδριακής Η+-ΑΤΡ-συνθετάσης από ολιγομυκίνη, η οποία εμποδίζει την παραγωγή ΑΤΡ από τα μιτοχόνδρια (Chang and Reynolds, 2006), και αναστολής του GADPH από ιωδοξεικό που επηρεάζει την FAT σε καλλιεργημένους νευρώνες του φλοιού Μια θεραπεία 5 λεπτά με ολιγομυκίνη (20 mM) προκάλεσε μια μείωση 25% στο ΑΤΡ που έφθασε στο 80% μετά από 30 λεπτά. Αντίθετα, μετά 30 λεπτά θεραπείας ιωδοοξικό που οδηγεί σε μια ισχυρή αναστολή της GAPDH μείωσε το ΑΤΡ μόνο κατά 40%. Τα αποτελέσματα φανερώνουν η μείωση του ΑΤΡ (γενικά μέσα στο κύτταρο) είναι μεγαλύτερη με αναστολλή της δράσης των μιτοχονδρίων απο ότι με την αναστολλή της δράσης του ενζύμου GADPH

6 Συνεισφορά μιτοχονδρίων και GAPDH στην ταχεία αξονική μεταφορά
Στη συνέχεια αξιολογήθηκαν τα αποτελέσματα αυτών των ουσιών στην κυστιδιακή μεταφορά παρουσία BDNF Μετά από 30 λεπτά δράσης της ολιγομυκίνης και ενώ το ποσοστό του ΑΤΡ στο κύτταρο είχε φτάσει στο ελάχιστο, η ταχύτητα της κυστιδιακής μεταφοράς παρέμεινε ανεπηρρέαστη. Η δράση του ιωδοοξικού μετά από 5 λεπτά οδήγησε σε αναστολή της FAT Μολονότι ολιγομυκίνη δεν είχε καμία επίδραση στη μεταφορά BDNF (νευροτροφικό παράγοντα προερχόμενο απο τον εγκέφαλο) κυστιδίων, μπλοκάρει γρήγορα την μεταφορά μιτοχονδρίων. Από την άλλη πλευρά, ιωδοοξικό δεν είχε καμία επίδραση στη δυναμική μιτοχονδρίων, ακόμη και μετά από 30 λεπτά της θεραπείας. Αυτό δείχνει την έλλειψη αποτελεσμάτων του ιωδοοξικού επί μοριακών κινητήρων, επειδή οι ​​ίδιες κινητήρες που χρησιμοποιούνται για μιτοχονδρίων και κυστίδια

7 Συνεισφορά μιτοχονδρίων και GAPDH στην ταχεία αξονική μεταφορά
Τα αποτελέσματα αυτά είναι σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες που δείχνουν ότι η απώλεια της μιτοχονδριακής παραγωγής ATP, και όχι η διαταραχή του μιτοχονδριακού μεμβρανικού δυναμικού ή της μιτοχονδριακής μορφολογίας μπορεί να προκαλέσει την απώλεια της δυναμικής των μιτοχονδρίων Στην συνέχεια με knock out των πρωτεϊνών adaptor για μιτοχονδρια milton και miro για να συγκεντρωθούν τα μιτοχόνδρια στο κυτταρικό σώμα. Παρόλα αυτά συνεχίσαμε να έχουμε φυσιολογική κατανομή των κυστιδίων στο νευράξονα. Επομένως έχουμε ότι η κυστιδιακή μεταφορά BDNF συνεχίζεται παρόλη τη μείωση του κυτταρικού ΑΤΡ και την αναστολλή της λειτουργίας των μιτοχονδρίων

8 Αποτελέσματα της αποσιώπησης του γονιδίου του GAPDH στην FAT
Τέλος έγινε αποσιώπηση του γονιδίου του GADPH μέσω siRNAs σε νευρώνες ποντικού Αυτό είχε ως αποτέλεσμα τη σταδιακή μείωση των επιπέδων GADPH και στη συνέψεια παρατηρήθηκε αξιοσημείωτη μείωση στην κυστιδιακή BDNF μεταφορά Τέλος έγινε έκφραση του GADPH σημασμένου με GFP πρωτεϊνη και είδαμε επαναφορά της φυσιολογικής κυστιδιακής BDNF μεταφοράς Εκτός από το ρόλο της στην γλυκόλυση, το GAPDH ενεργεί και σε άλλες κυτταρικές διαδικασίες όπως η επιδιόρθωση του DNA, η σύντηξη μεμβράνης, η κυτταροσκελετική δυναμική, και ο θάνατος των κυττάρων

9 Αποτελέσματα της αποσιώπησης του γονιδίου GAPDH in vivo στην Drosophila
Επειδή η γλυκόλυση είναι κύρια πηγή ΑΤΡ σε καλλιέργεια νευρώνων, ελέγχουμε τα αποτελέσματα της απώλειας του GADPH in vivo στη drosophila Για την καταγραφή της αξονικής μεταφοράς εκμεταλευτίκαμε τη διαφάνεια των προνύμφων(Pilling et al., 2006). Οι προνύμφες στο στάδιο L3 τοποθετήθηκαν ανάμεσα σε δύο καλυπτρίδες και εξετάσθηκαν από βιντεομικροσκοπία Καταλήξαμε λοιπόν στο συμπέρασμα ότι η αξονική μεταφορά κυστιδίων βασίζεται στο GADPH ενώ των μιτοχονδρίων όχι Μαζί, τα αποτελέσματά μας σε φλοιώδεις νευρώνες και σε προνύμφες Drosophila αποδεικνύουν ότι (1) GAPDH απαιτείται για την FAT in vitro και in νίνο, (2) Ο μηχανισμός αυτός θα μπορούσε να γενικευτεί, και (3) αυτή η κρίσιμη λειτουργία είναι εξελικτικά συντηρημένη

10 Εντοπισμός του GAPDH σε μεταφορικά κυστίδια
Πραγματοποιήσαμε υποκυτταρική κλασματοποίηση του εγκεφάλου ποντικιών και διαπιστώσαμε παρουσία GADPH σΕ '' μικρά κυστίδια '' ( P3) που περιείχαν επίσης συναπτοφυσίνη , BDNF και τις p50 και p150 υπομονάδες dynactin . Ανιχνεύσαμε επίσης dynein ενδιάμεσης αλυσίδας ( DIC) και κινεσίνη βαριάς αλυσίδας ( KHC ), που είναι υπομονάδες των αντίστοιχων μοριακών κινητήρων , dynein και κινεσίνης - 1. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκαν πειράματα ανοσοφθορισμού για ενδογενή GAPDH σε νευρώνες που υποβλήθηκαν σε ηλεκτροδιάτρηση με BDNF - mCherry . Εμείς διαπερατοποιήσαμε πρώτα κύτταρα με σαπονίνη πριν την μονιμοποίηση για να αφαιρεθεί η άφθονη κυτοσολικής ποσότητα του GAPDH Βρήκαμε μια ισχυρή συνεντόπιση ενδογενούς GAPDH σε κυστίδια που περιέχουν BDNF κατά μήκος αξόνων όπως δείχνεται με συνεστιακή μικροσκόπηση σε ποσοστό περίπου 77%

11 Εντοπισμός του GAPDH σε μεταφορικά κυστίδια
Για την περαιτέρω αποδείξει ότι GAPDH είναι παρών σε ‘κινητικά κυστίδια’ και έχει ένα λειτουργικό ρόλο, προσαρμόσαμε ένα προηγουμένως αναφερθέν πρωτόκολλο (Perlson et αϊ., 2009) για τον καθαρισμό δυναμικά κυστίδια από τους εγκεφάλους Thy1-ρ50-GFP διαγονιδιακών ποντικών (M30 γραμμή) που εκφράζουν την p50 υπομονάδα του dynamitin dynactin συγχωνευμένου με τη GFP υπό τον νευρωνικό υποκινητή Thy1 H μέθοδος αυτή μας επέτρεψε τον ιδιαίτερο καθαρισμό κυστιδίων που περιέχουν ρ50-GFP και το σύμπλοκο μοριακών κινητήρων, καθώς και πρωτεΐνες που συνδέονται σε αυτά τα κινητικά κυστίδια. Στα διάφορα τμήματα που προέκυψαν εντοπίστικε και κινάση του φώσφογλυκερικού εκτός από το GAPDH

12 Εντοπισμός του GAPDH σε μεταφορικά κυστίδια
Dynabeads συζευγμένα με αντι-GFP αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για να καθαριστούν φυσικά άθικτα κυστίδια από το κλάσμα κυστιδίων (VF), που στη συνέχεια επισημάνθηκαν με ένα λιπόφιλο δείκτη Αυτά τα κινητικά κυστίδια ήταν ανοσοθετικά για GAPDH υποδηλώνοντας εντοπισμός του GAPDH είναι στην κυτοσολική επιφάνεια των κυστιδίων

13 Το GAPDH δρα στα κυστίδια και παράγει ΑΤΡ
Πρώτα, καθαρίσαμε τα κινητικά κυστίδια που ήταν περιείχαν δραστικότητα GAPDH. Στη συνέχεια, επωάσαμε τον κλάσμα κινητικών κυστιδίων (ΙΡ) με φωσφορική-3-γλυκεραλδεϋδη, ADP, Pi και NAD + για τη μέτρηση της παραγωγής ΑΤΡ Παρατηρήσαμε μια ταχεία και σημαντική παραγωγή ATP υπό αυτές τις συνθήκες που δείχνουν ότι τόσο GAPDH και η κινάση του φώσφογλυκερικού είναι ενζυμικά ενεργή. Η παραγωγή ΑΤΡ απαιτεί πλήρη καταλυτική λειτουργία GAPDH, αφού ήταν εντελώς αποκλεισμένη από ιωδοξεικό Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα κινητικά κυστίδια περιέχουν λειτουργικές γλυκολυτικές μηχανές και παράγουν ATP κατά τρόπο αυτόνομο

14 Το κυστιδιακό GAPDH μεταφέρεται στους νευράξονες
Έγινε έκφραση του GAPDH-GFP σε φλοιώδεις νευρώνες και χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση νευραξόνων με βιντεομικροσκοπία για την παρουσία του GAPDH-GFP-σημασμένων δυναμικών κυστιδίων Καθώς GAPDH είναι κυρίως κυτοσολικού, έχουμε λεύκανση πρώτα τον άξονα εντός του μικροδιαύλου για την αποπληρωμή υφιστάμενων φθορισμού Παρατηρήσαμε ότι κινούνται γρήγορα GAPDH-GFP-θετικά κυστίδια

15 Συμμεταφορά GAPDH και mBDNF-cherry
Όπως φαίνεται από τις αναλύσεις ταινίας και κυματογράφο, τα περισσότερα από τα κυστίδια που περιέχουν δυναμικό BDNF-mCherry ήταν επίσης θετικά για GAPDH-GFP Θα μπορούσαμε επίσης να ανιχνεύσουμε δυναμικά GAPDH-GFP-θετικά κυστίδια τα οποία ήταν αρνητικά για τον BDNF-mCherry υποστηρίζοντας έναν ευρύτερο ρόλο του GAPDH στην μεταφορά άλλων κυστιδίων όπως συναπτοταγμίνης, ΑΡΡ και κυστίδια που περιέχουν TrkB Τα ευρήματα δείχνουν ότι το κυστιδιακό GAPDH θα μπορούσε να παράσχει την απαραίτητη ενέργεια για την αξονική μεταφορά.

16 Το κυστιδιακό GAPDH είναι επαρκές για τη προώθηση της ταχείας αξονικής μεταφοράς
Για τον καθορισμό του αν το κυστιδιακό GAPDH είναι επαρκές για ταχεία αξονική μεταφορά, έγινε αποσιώπηση του ενδογενούς GAPDH και κατευθύνθηκε το GAPDH σε κυστίδια μέσω σύντηξης του με την διαμεμβρανική συναπτοταγμίνης (TM-GAPDH-GFP) Παρατηρήθηκε επίσης πλήρης εξαφάνιση όλων των μορφών GAPDH από το κυτταρόπλασμα Μεταξύ των GAPDH και BDNF-mCherry παρατηρήθηκε ισχυρή αλληλοεπικάλυψη (περίπου 72%) Επανέκφραση του TM-GAPDH ήταν επαρκής για την επαναφορά της φυσιολογικής FAT, ενώ αντίθετα μια τροποποιημένη ανενεργή μορφή του GAPDH δεν ήταν επαρκής Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι ένα αυστηρά κυστιδιακό GAPDH είναι επαρκές για να ωθήσει τα κυστίδια σε νευράξονες.

17 Η huntingtin δεσμέυει το GAPDH στα κυστίδια
Το GAPDH αλληλεπιδρά με huntingtin (HTT), η πρωτεΐνη που όταν μεταλλάσσονται προκαλεί τη νόσο του Huntington (Bae et al., 2006; Burke et al., 1996; Culver et al., 2012; Goehler et al., 2004; Kaltenbach et al., 2007; Ratovitski et al., 2012).Η HTT εντοπίζεται σε κυστίδια και αποτελεί απαραίτητη δεσμευτική πρωτεΐνη για τη ρύθμιση της αξονικής μεταφορά των κυστιδίων, συμπεριλαμβανομένων BDNF Τα αποτελέσματα των πειραμάτων μετά από αποσιώπηση του γονιδίου της huntingtin μέσω siRNAs έδειξαν ότι η πρωτεϊνη αυτή είναι απαραίτητη για τη δέσμευση του GAPDH στα κυστίδια Επίσης τα αποτελέσματα μας επιπλέον δείχνουν ότι το GAPDH εντοπίζεται σε συγκεκριμένες θέσεις στα κυστίδια

18 Το κυστιδιακό GAPDH είναι απαραίτητο για την ταχεία αξονική μεταφορά
Από τα προηγούμενα αποτελέσματα είδαμε ότι παρόλο που με την έλλειψη huntingtin το GAPDH στο κυτταρόπλασμα παρέμενε δεν αρκούσε για την ταχεία αξονική μεταφορά Χρησιμοποιήσαμε δύο siRNA που στοχεύουν διαφορετικές ακολουθίες του ΗΤΤ και διαπιστώθηκε ότι η RNAi μείωση FAT ήταν παρόμοια με εκείνη της σίγασης του GAPDH σε νευρώνες Έχουμε εκ νέου-εκφρασμένο TM-GAPDH στους νευρώνες με σποσιώπηση στο γονίδιο HTT και διαπιστώσαμε ότι διασώθηκε η αξονική μεταφορά και στις δύο κατευθύνσεις Μαζί, συμπεραίνουμε ότι το κυστιδιακό αλλά όχι το κυτοσολικό GAPDH απαιτείται για να ωθήσει κυστίδια σε ταχεία αξονική μεταφορά

19 Take home message Τα γλυκολυτικά ένζυμα βρίσκονται σε κυστίδια παρά τα μιτοχόνδρια είναι κρίσιμης σημασίας για τη διατήρηση των υψηλών ταχυτήτων που είναι χαρακτηριστικές του FAT Το GAPDH είναι μια πολύ άφθονη πρωτεΐνη στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα και αλληλεπιδρά με μικροσωληνίσκους και μεμβράνες Μολονότι παρουσιάζουμε έναν κρίσιμο ρόλο για HTT στην προσκόλληση GAPDH σε κυστίδια, εξακολουθεί να είναι πιθανό ότι οι άλλοι μηχανισμοί συνυπάρχουν (π.χ. Rab2 GTPase,Tisdale et al., 2004) Το σύστημα της κίνησης των κυστιδίων τέλος φαίνεται να είναι ενεργειακά ανεξάρτητο από τον υπόλοιπο νευρώνα

20 Βιβλιογραφία-Refrences
Diana Zala et al, Vesicular Glycolysis Provides On-Board Energy for Fast Axonal Transport (2013);152:

21 Ευχαριστώ πολύ για την προσοχή σας