UTILITATEA ELASTOGRAFIEI ULTRASONOGRAFICE

Παρουσίαση με θέμα: "UTILITATEA ELASTOGRAFIEI ULTRASONOGRAFICE"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 UTILITATEA ELASTOGRAFIEI ULTRASONOGRAFICE
ŞI A REZONANŢEI MAGNETICE CA METODE NEINVAZIVE COMPLEMENTARE DE EVALUARE A FIBROZEI ÎN AFECŢIUNILE HEPATICE CRONICE

2 INSTITUTUL NAŢIONAL DE BOLI INFECŢIOASE
INBI Matei Balş INSTITUTUL NAŢIONAL DE BOLI INFECŢIOASE "PROF. DR. MATEI BALŞ" CO Bucureşti, Strada Dr. Grozovici, nr. 1, sector 2, cod poştal , telefon (021) , fax (021) , Director proiect:  Conf. univ. dr. Florin CĂRUNTU

3 UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE DIN CRAIOVA
P1 UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE DIN CRAIOVA Responsabil ştiinţific proiect:  Prof. univ. dr. Tudorel CIUREA

4 SPITALUL CLINIC JUDEŢEAN DE URGENŢĂ CRAIOVA
INBI Matei Balş PROCESAREA AVANSATĂ A INFORMAŢIEI MEDICALE ÎN VEDEREA TRANSFERĂRII REZULTATELOR CERCETĂRII PENTRU ASIGURAREA SĂNĂTĂŢII UMANE ÎN TRATAREA UNOR BOLI INFECŢIOASE P2 SPITALUL CLINIC JUDEŢEAN DE URGENŢĂ CRAIOVA Responsabil ştiinţific proiect:  Dr. Cristina Mariana CALANGIU

5 INBI P3 Responsabil ştiinţific proiect:  Dr. Bogdan POPA Matei Balş
PROCESAREA AVANSATĂ A INFORMAŢIEI MEDICALE ÎN VEDEREA TRANSFERĂRII REZULTATELOR CERCETĂRII PENTRU ASIGURAREA SĂNĂTĂŢII UMANE ÎN TRATAREA UNOR BOLI INFECŢIOASE P3 Responsabil ştiinţific proiect:  Dr. Bogdan POPA

6 ROLUL TEHNICILOR IMUNOHISTOCHIMICE PENTRU EVALUAREA ACTIVITĂŢII NECROINFLAMATORII ŞI PREDICŢIA ÎN BOLILE HEPATICE CRONICE

7 Evaluarea are in vedere un lot de puncţii biopsii hepatice din punct de vedere al prezenţei şi importanţei modificărilor histologice întâlnite în diferitele forme de hepatite cronice, cât şi evidenţierea imunohistochimică atât a componentelor infiltratului inflamator cronic cât şi a necrozei celulare evidenţiate în aceste afecţiuni. Fragmentele recoltate au fost incluse la parafină prin metoda clasică până la obţinerea blocurilor de parafină.

8 Din acestea au fost efectuate secţiuni la 4 microni care au fost colorate cu:
 Hematoxilină-Eozină (HE),  coloraţii speciale:  PAS,  Tricrom Masson,  impregnaţie argentică Gömöri.

9 Pentru studiul imunohistochimic, au fost efectuate secţiuni la 3 microni care au fost etalate pe lame cu polilizină şi apoi prelucrate prin metoda imunohistochimica ABC (avidin – biotin - complex peroxidază) folosindu-se anticorpi specifici:  anti-limfocite T (CD45RO),  anti-limfocite B (CD 20)  anticorpi pentru evaluarea activităţii necrotico- inflamatorii (TGF-β).

10 Secţiunile hepatice colorate după modul de mai sus au fost evaluate cu ajutorul Indexului Activităţii Histologice (HAI) descris de Knodell si Metavir. Studiul va fi continuat, în etapa următoare, prin evaluarea imunohistochimică a prezenţei diferitelor subtipuri de limfocite T (CD4 şi CD8) şi a fibrozei hepatice prin prezenţa colagenului de tip IV.

11 ROLUL TEHNICILOR IMUNOHISTOCHIMICE PENTRU EVALUAREA ACTIVITĂŢII NECROTICO-INFLAMATORII ŞI PREDICŢIA FIBROZEI ÎN HEPATITELE CRONICE VIRALE

12 Studiul statistic a fost efectuat pe un număr de 74 de puncţii biopsii hepatice. Pentru evaluarea histologică a importanţei şi evoluţiei modificărilor hepatice, cât şi pentru evidenţierea imunohistochimică a markerilor virali, este necesar examenul histopatologic pe material obţinut prin puncţia biopsie hepatică.

13 Fragmentele recoltate parcurg următorii paşi până la interpretarea histopatologică:
 sunt fixate în formol 10% la temperatura camerei, timp de de ore;  sunt prelucrate pentru includerea la parafină;  se secţionează blocul de parafină şi secţiunile obţinute sunt colorate cu:  Hematoxilină-Eozină (HE),  coloraţii speciale:  PAS,  Tricrom Masson,

14  impregnaţie argentică Gömöri;
 secţiunile sunt pregătite pentru examenul imunohistochimic (IHC). Secţiunile hepatice colorate după modul de mai sus au fost evaluate cu ajutorul Indexului Activităţii Histologice (HAI) descris de Knodell si Metavir.

15 Acurateţea diagnosticului şi histoprognosticului depind de calitatea specimenului prelevat prin puncţie biopsie, astfel:  fragmentele reprezentative conţin 3-5 spaţii porte;  vor fi apreciate dimensiunile şi componentele spaţiului port, care la normal conţine o venulă, 1-2 arteriole şi 1-2 ducte biliare (infiltratul periductal şi necrozele epiteliului biliar sugerează ciroza biliară primitivă);

16 . celularitatea stromală a spaţiului port este săracă la
 celularitatea stromală a spaţiului port este săracă la normal, conţinând rare fibroblaste, limfocite (sub 5/câmp x400), macrofage şi plasmocite;  prezenţa infiltratului inflamator presupune aprecierea densităţii, compoziţiei şi localizării sale, raportate la zonele acinului hepatic.

17 Examinarea preparatelor necesită o atenţie specială, în funcţie de etiologia hepatitei cronice:
 pentru hepatitele cronice cu virus C, care evoluează perioade relativ îndelungate sub aspect histopatologic de hepatită cronică persistentă;  s-au evaluat densitatea şi componentele infiltratului, această evaluare fiind utilă pentru diagnosticul microscopic diferenţial (hepatită cronică persistentă versus determinări hepatice în leucemia limfoidă);

18 . pentru hepatita alcoolică - la venula hepatică
 pentru hepatita alcoolică - la venula hepatică terminală se observă primele leziuni:  fibroza perivenulară;  fibroza perivenulară se observă mai dificil la coloraţia hematoxilină-eozină, motiv pentru care s-au folosit coloraţiile speciale: VG, Tricrom Masson;  examinarea biopsiilor hepatice cu obiectiv mic a permis aprecieri asupra arhitecturii, numărului de spaţii porte, a raportului sinusoide-hepatocite;

19 . evidenţierea fibrelor de reticulină s-a făcut prin
 evidenţierea fibrelor de reticulină s-a făcut prin impregnaţie argentică Gömöri;  permite aprecieri asupra modificărilor arhitecturale ale parenchimului hepatic (colapsul reţelei de fibre argirofile) şi semnalează arii mici de necroză şi de regenerare;  la nivelul citoplasmei au fost evaluate depozitele de glicogen, staza biliară intrahepatocitară, prezenţa vacuolelor, a transformării hialine (corpii Mallory) şi a depozitelor de hemosiderină şi cupru;

20 . identificarea spaţiului portal iniţial din zonele de
 identificarea spaţiului portal iniţial din zonele de „piecemeal necrosis” s-a făcut utilizând coloraţiile pentru colagen, care permit diferenţierea fibrelor grosolane de colagen de tip I din spaţiile porte, faţă de fibrele fine de colagen de tip III (fibre de reticulină), care apar în primele stadii ale leziunilor de „piecemeal necrosis”.

21 Preparatele histopatologice au fost examinate, iar cele reprezentative au fost fotografiate cu ajutorul microscopului Nikon E 600 prevăzut cu cameră de achiziţie video. Pe preparatele obţinute prin puncţie biopsie hepatică s-a evaluat expresia imunohistochimică a markerilor infiltratului limfoid şi TGF-beta prin metoda ABC (avidin- biotin- complex peroxidază) care permite vizualizarea prin reacţii Ag-Ac succesive cu molecule din ce în ce mai mari şi în final colorate cu diaminobenzidină (DAB).

22 HEPATITELE CRONICE VIRALE

23 Studiul statistic efectuat, a relevat existenţa a 74 de puncţii biopsii hepatice, efectuate pentru stabilirea diagnosticului de hepatită cronică. Repartiţia pe grupe de vârstă şi sex a hepatitelor cronice este reprezentată în tabelul nr 1.

24 Tabel 1: Repartiţia cazurilor de hepatită cronică în funcţie de grupa de vârstă şi sex

25 În ceea ce priveşte tipul de hepatită cronică, după Indexul Activităţii Histologice (HAI) descris de Knodell şi după scorul METAVIR, din cele 74 puncţii biopsii hepatice:  31 cazuri au fost de hepatită cronică minimal activă;  38 cazuri au fost cu hepatită cronică moderat activă;  8 cazuri cu hepatită cronică sever activă. Repartiţia cazurilor de hepatită cronică în funcţie de leziunile descrise după HAI şi METAVIR, se observă în tabelul nr 2.

26 Tabel 2: Repartiţia cazurilor de hepatită cronică în funcţie de HAI şi scorul METAVIR

27 HEPATITA CRONICĂ MINIMAL ACTIVĂ

28 Hepatita cronică minimal activă a fost prezentă în 31 cazuri:
 sexul feminin a fost reprezentat in 19 cazuri  vârstele extreme au fost reprezentate de 27 şi 60 de ani şi au aparţinut sexului masculin. Examenul microscopic La interpretarea histologică cele 31 puncţii hepatice au avut:  scorul Knodell 2-4,  scorul METAVIR A1F1 A1F2.

29 Se remarcă piecemeal necrosis doar în unele spaţii porte sau, în 2 cazuri, într-un singur segment al perimetrului spaţiului port. Necrozele sunt parcelare şi au fost ocazionale. Modificările intralobulare au fost minime şi au constat din mici focare de necroză hepatocitară cu reacţie inflamatorie modestă. Fibroza a fost prezentă în spaţiile porte si in septuri.

30 Conform scorului Knodell avem următoarele modificări:
 I.B. uşoară piecemeal necrosis (scor 1);  II.B. degenerare intralobulară uşoară şi/sau rare focare de necroză hepatocelulară 1/3 din lobuli (scor 1);  III.A sau B. inflamaţie portală absentă sau uşoară în 1/3 din spaţiile porte (scor 0-1);  IV. A sau B fibroză absentă sau expansiune fibroasă portală (scor 0-1). Rezultă că modificările hepatice întâlnite în cele 9 cazuri de hepatită cronică minimal activă au avut scorul Knodell cuprins între 2 şi 4.

31 Modificările hepatice întâlnite pe cele 31 biopsii hepatice conform scorului METAVIR au fost următoarele:  A1 – activitate necrotico-inflamatorie absentă sau uşoară (cel puţin un focar necrotico-inflamator pe lobul, piecemeal necrosis absentă sau ca alterare focală a plăcii periportale, inflamaţie doar în unele spaţii porte, steatoza 10% din hepatocite) ;  F0 sau F1 sau F2 – fibroză absentă sau portală fără septuri sau portală cu rare septuri.

32 Figura 1: Hepatită cronică minimal activă.
Se observă necroză focală şi inflamaţie portală, Col. Tricrom Mason, 100x

33 HEPATITA CRONICĂ MODERAT ACTIVĂ

34 Hepatita cronică moderat activă a fost prezentă în 38 de cazuri:
 sexul feminin a dominat cu 23 de cazuri, bolnavii având vârste cuprinse între 31 şi 60 de ani.

35 Examenul microscopic Hepatita cronică moderat activă s-a caracterizat prin inflamaţie densă portală şi periportală şi piecemeal necrosis extensivă, interesând 50% din circumferinţa aproape tuturor spaţiilor porte, rămânând în ariile periportale, iar necroza şi inflamaţia lobulară a fost semnificativă, cu afectarea 1/3-2/3 din lobul;  scorul Knodell a fost între 8 şi 12,  scorul METAVIR a fost A2 sau 3 F2 sau 3,  scorul Batts şi Ludwig a fost G3F2.

36 Modificările histologice prezente în hepatita cronică moderat activă au avut scorul Knodell cuprins între 8 şi 12 şi au fost următoarele:  I.C. moderată piecemeal necrosis 50% din circumferinţa majorităţii spaţiilor porte (scor 3);  II.C. degenerare intralobulară şi necroză focală moderată, afectând 1/3-2/3 din lobuli (scor 3);  III.B sau C. Inflamaţie portală uşoară ( 1/3 din spaţiile porte) sau moderată (1/3-2/3 din spaţiile porte) (scor 1 sau 3);  IV.B sau C. Fibroză portală, C - fibroză în punţi porto-portale sau porto-centrale (scor 1 sau 3).

37 Scorul METAVIR a fost de A2 sau 3 F2 sau 3 şi a prezentat următoarele modificări histologice:
 A2 sau 3 – piecemeal necrosis în jurul tuturor spaţiilor porte mai multe focare necrotico- inflamatorii sau alterare difuză a plăcii periportale în toate spaţiile porte;  F2 sau 3 – fibroză portală cu rare septuri sau numeroase septuri.

38 Figura 2:. Hepatită cronică moderat activă – acelaşi caz – inflamaţie
Figura 2: Hepatită cronică moderat activă – acelaşi caz – inflamaţie nodulară şi fibroză portală Steatoză intralobulară, col. H-E, 100x

39 HEPATITA CRONICĂ SEVER ACTIVĂ

40 Hepatita cronică sever activă a fost prezentă în 6 cazuri
Hepatita cronică sever activă a fost prezentă în 6 cazuri. Repartiţia pe sexe a fost aproximativ egală, sexul cu unul mai mult faţă de cel masculin (9 cazuri). Vârstele extreme au fost de 44 şi 64 ani.

41 Examenul microscopic  Cazurile s-au caracterizat prin piecemeal necrosis în aproape toată circumferinţa periportală şi de-a lungul septurilor fibroase.  Necroza confluentă în punţi (bridging necrosis) a fost mascată de septurile fibroase porto-portale.  Septurile pasive sunt rezultatul colapsului datorat necrozei confluente şi coexistă cu septurile active.  Alterarea lobulară a interesat  2/3 din lobuli.  Scorul Knodell a fost între 15 şi 18,  Scorul METAVIR a fost A3 F3 sau 4.

42 Modificările histologice prezente în hepatita cronică sever activă au avut scorul Knodell cuprins între 15 şi 18 şi au fost următoarele:  I.D, sau E sau F. marcată piecemeal necrosis 50% din circumferinţa majorităţii spaţiilor porte, E – moderată piecemeal necrosis+necroză în punţi, F marcată piecemeal necrosis + necroză în punţi (scor 4, 5, 6);  II.D. degenerare intralobulară şi necroză focală marcată, afectând 2/3 din lobuli (scor 4);

43 . III. D. Inflamaţie portală marcată (arii dense cu
 III.D. Inflamaţie portală marcată (arii dense cu celule inflamatorii în 2/3 din spaţiile porte), scor 4;  IV.C sau D. Fibroză în punţi porto-portale sau porto-centrale, D - ciroză (scor 3 sau 4).

44 Scorul METAVIR a fost de A3 F3 sau 4 şi a prezentat următoarele modificări histologice:
 A3 – piecemeal necrosis în jurul tuturor spaţiilor porte şi mai multe focare necrotico-inflamatorii sau alterare difuză a plăcii periportale în toate spaţiile porte;  F3 sau 4 – numeroase septuri +/- ciroză.

45 La nivelul parenchimului hepatic se observă infiltrat limfocitar moderat la nivelul spaţiului port şi fibroză portală. Intralobular este prezent infiltratul inflamator moderat. Scorul Knodell a fost de 7, scorul METAVIR A2F2. Alături de modificările din hepatita cronică moderat activă, la nivelul parenchimului hepatic s-au observat zone cu celule predominant rotunde, uni- sau multinucleate, cu tahicromazie nucleo-citoplasmatică, alături de zone de necroză şi zone de fibroză.

46 Figura 3: Hepatită cronică sever activă.
Steatoză, fibroză şi inflamaţie intralobulară. Col. H-E, 40x

47 . La nivelul parenchimului hepatic se remarcă
 La nivelul parenchimului hepatic se remarcă fibroză şi inflamaţie dense, în toate spaţiile porte, cu prinderea în totalitate a acestora, cu distorsionarea arhitecturii de organ;  intralobular, degenerescenţa granulo- vacuolară este semnificativă, interesând peste 2/3 din lobul.  Capilarele sinusoide sunt dilatate difuz în aria centro-lobulară şi periportală şi cu conţinut limfocitar;  în câteva zone este prezentă fibroza în punţi cu schiţare de noduli de regenerare.

48 Interactiunea dintre fibroza si alte modificari a fost luata in considerare in functie de mai multi parametri:  Activitatea necroinflamatorie (inflamatie portala, activitate lobulara si peacemealnecrosis) a permis incadrarea in unul din tipurile de hepatita descrise mai sus; la aceasta s-a adaugat studiul fibrozei  F1 – 2 cazuri,  F cazuri,  F cazuri.

49  Steatoza a fost asociata in 35 de cazuri:
 steatoza usoara 12 cazuri,  steatoza moderata 17 cazuri,  steatoza marcata in 6 cazuri;  Infiltratul inflamator este format din limfoplasmocite; bogat in limfocite T atat in spatiul port cat si intralobular sugerand rolul important pe care il joaca limfocitele T atat in procesul necro inflamator cat si in inducerea apoptozei;

50  Infiltratul inflamator a fost evaluat si notat dupa cum urmeaza:
 + slab,  ++ moderat,  +++ sever.  Cuantificarea a fost facuta la microscopul optic, obiectiv X10, atat pentru limfocitele B cat si pentru limfocitele T.

51 Tabel 3: Evaluarea infiltratului inflamator

52 Se remarca predominenta limfocitelor T in infiltratul inflamator
Se remarca predominenta limfocitelor T in infiltratul inflamator. In urmatoarele etape vom studia subgrupele de limfocite T (CD4, CD8) si rolul lor in activitatea necro inflamatorie si in inducerea fibrogenezei. Un rol important în evoluţia hepatitelor cronice îl joacă limfocitele T citotoxice, care recunosc antigenele virale de pe suprafaţa hepatocitelor şi pot distruge hepatocitele infectate cu virusul hepatitei B. Această supoziţie nu explică totuşi, diferenţele de pronostic între cei care se vindecă după o hepatită acută B şi cei care evoluează spre o hepatită cronică B.

53 Şi la bolnavii infectaţi cu virusul hepatitic C au fost efectuate studii ale răspunsului imunologic al limfocitelor T, comparându-se diferenţiat CD4 şi CD8. Rezultatele arată că proliferarea limfocitelor T CD4+ este intensă şi se menţine mai mult timp după vindecarea clinică a bolnavilor infectaţi cu virusul C, în timp ce la bolnavii cu hepatită cronică persistentă, este slabă. În contrast, răspunsul limfocitelor T citotoxice CD8+ este scăzut la ambele grupuri.

54 Figura 4: Imunomarcaj pentru CD20 - infiltrat limfocitar scazut +, 100x

55 Figura 5:. Imunomarcaj pentru CD20, infiltrat inflamator sever +++,
Figura 5: Imunomarcaj pentru CD20, infiltrat inflamator sever +++, 200x

56 Figura 6:. Imunomarcaj pentru CD45, infiltrat inflamator sever +++,
Figura 6: Imunomarcaj pentru CD45, infiltrat inflamator sever +++, 200x

57 Figura 7:. Imunomarcaj pentru CD45, infiltrat inflamatot sever +++,
Figura 7: Imunomarcaj pentru CD45, infiltrat inflamatot sever +++, 100x

58 In hepatitele cronice atat TNF alfa cat si TNF beta sunt prezente intrahepatocitar .productia acestora depinde de infiltratul inflamator . Noi am studiat TGF beta este un marker important in progresia fibrozei TGF beta a fost mai scazut la pacientii cu hepatita C cu fibroza scazuta (F1 2cazuri) moderat pozitiv in 24 cazuri(F2) si intens pozitiv in 32 cazuri (F3).

59 Figura 8:. Imunomarcaj pentru TGF-β pozitiv în hepatocitele situate în
Figura 8: Imunomarcaj pentru TGF-β pozitiv în hepatocitele situate în vecinătatea infiltratului inflamator portal, 100x

60 Figura 9:. Imunomarcaj pentru TGF-β pozitiv in citoplasma
Figura 9: Imunomarcaj pentru TGF-β pozitiv in citoplasma hepatocitelor, 200x

61 Figura 10: Imunomarcaj pentru TGF-β pozitiv citoplasmatic, 100x

62 ECHIPA DE CERCETARE VĂ MULŢUMEŞTE PENTRU ATENŢIA ACORDATĂ!