Tehnici utilizate în biologia moleculară

Παρουσίαση με θέμα: "Tehnici utilizate în biologia moleculară"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Tehnici utilizate în biologia moleculară
Enzimele utilizate în biologia moleculară Enzimele de restricţie fac posibilă manipularea de tip recopiere, tăiere, lipire a secvenţelor acizilor nucleici. Acestea participă la fenomenul de restricţie, adică un sistem de apărare al bacteriilor faţă de bacteriofagi. Unele tulpini sau suşe bacteriene conţin enzime din familia endonucleaze şi decupează ADN la nivelul secvenţei recunoscută specific. Dacă o colonie bacteriană infectată de un bacteriofag sintetizează această enzimă, şi dacă bacteriofagul posedă în genom secvenţa recunoscută de enzimele de restricţie a bacteriilor, acesta va fi incapabil să se multiplice şi să lizeze bacteria.

2 Ca urmare ADN-ul său va fi secţionat în fragmente în care există situsuri specifice genomului fagic.
De ce ADN bacterian nu este distrus de aceste enzime? Există 2 posibilităţi: fie ADN bacterian nu conţine secvenţe recunoscute de enzimă, fie acesta este metilat la nivelul resturilor de A sau C de către metilaza bacteriană ceea ce determină nerecunoaşterea acestor secvenţe metilate de către enzimele de restricţie. Numele de restricţie vine de la faptul că există o restricţie a infecţiei fagilor faţă de anumite suşe bacteriene care sintetizează endonucleaze, altele fiind lizate. Numele enzimei de restricţie provine de la numele genului şi speciei de la care au fost izolate.

3

4 ADN polimeraza catalizează sinteza catenelor de ADN şi au rol în replicare şi în reparaţia ADN.
Ele necesită o matrice faţă de care se sintetizează secvenţa complementară. Este necesară iniţierea reacţiei de către o amorsă, prin intermediul căreia ADN polimeraza realizează elongaţia prin adiţia de precursori trinucleotidici dNTP. Enzimele particulare utilizate sunt: ADN pol I specifică E. coli şi fragmentul Klenow, ADN polimeraza fagilor T7 şi T4 şi ADN pol. termostabile. Transferaza terminală poate fi considerată o ADN pol. particulară. Această enzimă nu copie matricea dar adiţionează nucleotide la extremitatea 3' a lanţului de ADN.

5 ADN polimeraza catalizează 3 tipuri de reacţii:
-activitatea de ADNpol propriu-zisă necesită matrice ADN care este copiată prin extensie unei amorse. Polimeraza încorporează nucleotide începând la nivelul 3'OH a amorsei. -activitate exonucleazei 3'-5' in vitro este o activitate de reacţie care are ca scop eliminarea tuturor bazelor adăugate eronat în cursul sintezei lanţului de ADN. Eliminarea bazelor eronate este urmată de încorporarea bazei corecte cu ajutorul ADN polimerazei. Această activitate se exercită pe ADN simplu sau dublu catenar. - activitatea exonucleazei 5'-3', enzimele elimină nucleotidele de la 5' a ADN dublu catenar. Această activitate este utilizată în tehnica de marcaj prin translaţia secţiunii.

6

7 ADN polimeraza I Această enzimă a fost purificată la început din culturi bacteriene ale E. coli, exercită o activitate de ADN polimerază, astfel că are două activităţi de exonucleaze. Activitatea exonucleazică 5'-3' a ADN pol I poate fi exercitată pe un hibrid ARN/ADN , ea este rezultatul deci a unei activităţi de RNază H intrinsecă care constă în eliminarea unui lanţ de ARN prin activitatea exonucleazei 5'-3'. Această proprietate a fost exploatată în reacţia de revertranscripţie pentru eliberarea primului lanţ de ADN sintetizat şi va permite sinteza unuia secundar.

8 El va avea rol de amorsă necesară şi la sinteza celui de-al doilea lanţ complementar.
În activitatea exonucleazei 5'-3' a ADN pol I are loc eliminarea unui grup fosfat în 5', care duce la imposibilitatea reacţiei de elongaţie. În consecinţă domeniul de aplicaţie al acestei enzime este de a limita marcajul sondei prin translaţia secţiunii, aplicaţie în care ea este utilizată în strânsă legătură cu DNaza I.

9

10 Fragmentul Klenow se realizează printr-o proteoliză limitată a ADNpol I de la E.coli, enzimă monomerică care generează două fragmente, foarte mari. Ele au pierdut activitatea exonucleazică 5'-3' dar conservă activitatea exonucleazică 3'-5' şi cea de ADNpolimerază. Aplicaţiile fragmentului Klenow: secvenţierea după metoda Sanger sinteza unui lanţ de ADN complementar marcare izotopică (32PdNTP) a extremităţii 3' a ADN prin reacţia de schimbare a nucleotidelor reci contra nucleotidelor marcate, catalizată prin activitate exonucleazică.

11 ADN polimeraza bacteriofagului T4 şi T7 catalizează transferul fosforului radioactiv γ32P pe ATP.
Astfel ATP este marcat cu 32P pe a treia grupare a fosfatului de pe extremitatea 5 a fragmentului de ADN. Tehnica este aplicată pentru obţinerea oligonucleotidelor marcate care vor fi utilizate ca sonde pentru criblajul băncilor. T4 ADN polimeraza Această enzimă a fost izolată la început din bacterioagul T4. ADN pol T4 şi are o activitate exonucleazică 3'-5' foarte eficace pe ADN monocatenar şi este de 200 de ori mai activă decât fragmentului Klenow de la E.coli

12 T7 ADN polimeraza Această enzimă a fost obţinută prin izolarea ei de la bacteriofagul T7, după infecţia bacteriei E.coli cu fagul. Este caracterizată prin eficacitate de sinteză, replicarea rapidă a fagului în cursul ciclului de infecţie. Ea posedă în acelaşi timp o activitate exonucleazică 3'-5' puternic exprimată, de aproximativ de 1000 de ori mai mare decât a fragmentului Klenow. Această activitate importantă exonucleazică explică fidelitatea mare a T7 ADN pol. Aplicaţii principale: marcarea ADN în 3' mutageneza dirijată

13 T7 ADN pol modificată: secvenoza
Tratamentul chimic al T7 ADNpol modifică enzima diminuând considerabil activitatea lor exonucleazică. Enzimele obţinute – secvenoza 1.0 şi 2.0 sunt utilizate în reacţiile de secvenţializare de bună calitate. Prin genie genetică o versiune 2.0 a fost produsă 100%, lipsită de activitate exonucleazică dotată cu o mare activitate specifică mai puţin sensibilă la structura secundară ea este folosită la tehnica de secvenţializare.

14

15 Taq ADNpol şi enzimele operante au fost izolate din Thermus aquaticus
Taq ADNpol şi enzimele operante au fost izolate din Thermus aquaticus. Prezintă particularitatea de a se dezvolta în izvoare calde la 80˚C. Este supusă la temperaturi extreme. Este o ADN pol dependentă. Posedă de asemenea activitate exonucleazică 5'-3' dar este lipsită de funcţii corectoare. Temperatura optimă de funcţionare de 70-75˚C. Originea sa îi conferă o stabilitate remarcabilă la temperaturi înalte.

16 Această termorezistenţă stă la baza utilizării sale în metode de amplificare genică precum PCR în timpul cărora se efectuează numeroase cicluri termice care presupun temperaturi de 90-95˚C. Alt avantaj hibridarea amorselor cu matricea se face la o temperatură mai mare ceea ce determină hibridarea specifică. Un anumit număr de ADN pol termostabile au fost extrase din alte bacterii Archebacterii şi Eubacterii. Fiecare are o particularitate şi o utilizare specifică.

17

18 Revertranscriptaza Această enzimă retrotranscrie ARNm în ADNc. RT permite remontarea fluxului genă, ARN, proteine şi sinteza secvenţei complementare unui ARN numită ADNc efectuând acţiune inversă a transcripţiei. Există trei posibilităţi: începând de la amorsă sau primer specific începând de la oligo dT care permite activarea RT de la coada poliA a unui ARNm începând de la amorse aleatorii numite hexanucelotide . RT este o ADN polimerază ARN dependentă.

19 ARN polimeraza T7 ARNpol este produsă de bacteriofagul T7, are o specificitate crescută pentru situsul promotor al fagului T7 de iniţiere a transcripţiei. Este foarte utilizată pentru sinteza 5'-3' in vitro a ARN obţinând sonde ARN şi poate fi utilizată pentru secvenţializarea ADN clonat într-un vector care conţine secvenţa promotoare T7. Aplicaţii: sinteza ARN pornind de la ADN pentru obţinerea de sonde. SP6 ARNpolimeraza Spre deosebire de cealaltă enzimă aceasta este produsă de SP6 , cu afinitate foarte mare pentru secvenţa situsului promotor SP6. Este utilizată pentru sinteza sondelor ARN.

20

21 T3 ARNpolimeraza Este ADN dependentă având o mare afinitate pentru secvenţa promotorului bacteriofag T3, transcrie ADN în ARN de la 5' la 3'. Aplicaţii identice cu T7 ARNpolimeraza. QB replicaza este ARN dependentă in vitro având funcţia de replicare a ADN genomic al fagului QB. Ea identifică ADN de replicat pe baza structurii secundare. Enzime de modificare Fosfataza alcalină catalizează hidroliza grupării 5' PO4 a ADN şi ARN eliberând un rest fosfat şi creând o extremitate 5'OH. Aplicaţii: prevenirea legării vectorilor de clonaj pe ei însăşi eliminând posibilitatea de formare a legăturilor fosfodiester; eliminarea grupării 5'PO4 înainte de marcajul acizilor nucleici prin T4 polinucleotid kinaza.

22 Această enzimă este foarte des utilizată ca generator de semnal de unde natura dependentă de substratul utilizat în sisteme de detecţie a acizilor nucleici. Polinucleotidkinaza catalizează transferul unei grupe gama fosfat de la un ATP la extremitatea 5'OH a unui ADN sau a ARN. ADN nativ fosfatat în 5' este adesea necesar să fie tratat în prealabil cu fosfatază. În unele condiţii experimentale reacţia permite un schimb de fosfaţi între fosfatul poziţiei gamma a unui ATP şi fosfatul din 5' a unui ADN. Aceasta permite evitarea etapei de tratament al ADN cu fosfataza. Aplicaţii: marcarea unei sonde ADN sau ARN în 5' terminal; marcarea unei amorse utilizate pentru secvenţa markerilor radioactivi utilizând gamma 32P, gamma 33P şi gamma 35S.

23 ADN ligaza asigură formarea legăturilor fosfodiester între deoxiriboză 3'OH şi 5'PO4 a două nucleotide adiacente. Permite legarea sau lipirea a două ADN dublu catenare. Are într-un fel activitate inversă enzimelor de restricţie. Aplicaţii: subclonarea produşilor de amplificare în vectori. Există T4 ADN ligază care leagă extremitatea 5'PO4 a unui ADN sau ARN monocatenar cu extremitatea 3'OH. Nucleazele sunt enzime care ataca acizii nucleici fie de la extremitatea 5' sau 3' numite şi exonucleaze, fie din interior sau endonucleaze. ARNaza sau RNaze sunt endonucleaze care hidrolizează puntea fosfodiesterică de ARN: A, T1 şi H. - RNaza A extrasă din pancreasul de bovine distruge ARN monocatenar îndeosebi după resturile C şi U. Hibrizii ADN-ARN şi ARN dublu catenar sunt rezistenţi.

24 Inhibitorii de RNază Inhibă activitatea RNazelor şi împiedică distrugerea ARN de către acestea. Aplicaţii: protejează ARNm în cursul RT; creşte randamentul sintezei sondelor de ARN cu ajutorul ARN polimerazelor; toate aplicaţiile în care există riscul de degradare a ARN de către RNază Proteinaza K, enzimă utilizată de extracţia acizilor nucleici. Digeră celule întregi, nucleul chiar ţesuturi făcând astfel accesibil ADN şi ARN. Este stabilă la 40-60˚Cşi eficace în prezenţa detergenţilor, dintre care cel mai bun este SDS anionic.

25 Alţi detergenţi neionici pot fi utilizaţi Non I, P40 şi TWIN20.
Ea şi pierde activitatea proteazică la temperatua de 90˚C. Aplicaţii: extracţia acizilor nucleici. Agaraza permite eliberarea acizilor nucleici dintr-un gel de agaroză. Digeră agaroza, dar nu distruge acizii nucleici. Este un mijloc de extragere a ADN din agaroză.

26 Extracţie şi purificarea ADN
Extracţia ADN Comportă:recoltarea şi păstrarea probelor şi extracţia propriu-zisă Probele ADN trebuie potejate de: inhibitori ai enzimelor utilizate (inhibitori ai Taq polimerază), nucleaze care pot degrada acizii nucleici (ARN este în special sensibil). Frecvent sunt probe totale de sânge ele pot fi separate în plasma , ser şi leucocite. Alte medii curent folosite sunt din:culturi (fagi, bacterii), urină, lichid cefalorahidian, expectoraţii, probe rezultate prin puncţionare şi biopsie. Condiţii de prelevare Probele trebuiesc recoltate steril.

27 O probă de sânge poate fi colectată în tub uscat dacă cercetările obţinute se realizează din ser sau pe EDTA sau ACD dacă se lucrează pe plasmă. Este recomandată lizarea globulelor roşii înainte de extracţia ADN ( de exemplu liza cu clorură de amoniu) apoi purificarea globulelor albe. Dacă se utilizează un anticoagulant trebuie să ţinem cont de natura sa. Heparina este un inhibitor pentru Taq polimerază mai mult sau mai puţin dificil de eliminat după procesul de extracţie utilizat. Probele de sânge total destinat unei analize genetice ADN poate fi trimis prin poştă. Acesta poate fi conservat la 4°C câteva săptămâni Ţesuturile sunt bogate în nucleaze (proteaze, DNaze şi RNaze). În cazul LCR este recomandat păstrarea la frigider, imediat după recoltare. Este cunoscut faptul că LCR şi urina sunt medii bogate în inhibitori.

28 ARN este o moleculă fragilă, foarte sensibilă la RN azele care sunt frecvente în mediu până şi pe degete. În cazul studiilor de ARN probele sau fracţiunile lor trebuiesc congelate la -80°C în primele 3 ore după recoltare. Probele pot fi expediate în gheaţă carbonică. În timpul manipulării este indispensabil să evităm contaminarea probei şi ARN să fie conservat (este fragil). Se recomandă: purtarea mănuşilor, autoclavarea materialelor, utilizarea de pipete special rezervate acestui scop la capete cu filtre sterile.

29 În funcţie de tipul ADN-ului se cunosc 2 tehnici de extracţie pentru tipul genomic şi pentru cel plasmidic. Extracţia ADN cromozomial sau genomic Metoda fenol cloroform Extracţia ADN din sânge total este cea mai utilizată. Parcurge 3 etape: -liza celulelor şi denaturarea complexelor nucleoproteice pentru eliberarea ADN din mediul intracelular -extracţia propriu-zisă pentru eliminarea proteinelor -precipitarea pentru purificarea ADN

30 Obţinerea fracţiunii de extras
În practică ADN situat în celulele nucleate se recuperează centrifugând leucocitele pe baza gradientului de densitate. Se poate centrifuga tubul la viteză joasă şi se recoltează de la interfaţă dintre plasmă şi coagulul de globule roşii. După spălare cu soluţie tampon proba este gata de extracţie. În cazul mycobateriilor eliberarea acizilor nucleici necesită un tratament mai drastic pe bază de ultrasunete sau asociate cu sodă caustică şi încălzire, sau adăugând detergenţi SDS şi proteinaza K.

31 Este indispensabilă spargerea peretelui mycobacterian care este foarte rezistent.
Liza celulelor şi denaturarea complexelor nucleoproteice pentru eliberarea ADN din mediul intracelular Un sistem utilizat curent adaptat la toate tipurile de probe este amestecul detergent/proteinază care disociază ţesuturile, celulele, capsida virusurilor şi eliberaază acizii nucleici. Proteinaza K, enzimă utilizată pentru extracţia acizilor nucleici. Digeră celule întregi, nucleul chiar ţesuturi făcând astfel accesibil ADN şi ARN. Este stabilă la 40-60˚Cşi eficace în prezenţa detergenţilor, dintre care cel mai bun este SDS (dodecylsulfat de sodiu) anionic. Ea îşi pierde activitatea proteazică la temperatua de 90˚C.

32 Extracţia propriu-zisă
ADN conţinut în lizat este separat de proteine prin tehnica fenol/cloroform. Fenolul este un agent deproteinizant puternic. Adiţia sa la faza apoasă are ca efect denaturarea proteinelor din mediu. După centrifugare ele se depozitează, în timp ce acizii nucleici sunt situaţi în faza apoasă. După transferul fazei apose în alt tub, acizii nucleici sunt trataţi cu un amestec cloroform/alcool izoamilic pentru a elimina urmele de fenol (care este un produs toxic şi inhibitor al anumitor enzime inclusiv Taq polimeraza). În acest stadiu după centrifugarea şi eliminarea fazei organice acizii nucleici se găsesc solubilizaţi în faza apoasă.

33 Precipitarea ADN Permite obţinerea ADN pur, concentrat şi se face fie cu etanol 100% la -80°C, fie cu izopropanol (fără săruri şi la +4°C) mai ales pentru probe de volum mai mare. Este indispensabilă o spălare cu etanol 70% pentru eliminarea sărurilor. Precipitatul este transferat într-o soluţie tampon cu forţă ionică slabă în general utilizând tampon TE (Tris 10 mM şi EDTA 1 mM).

34

35 Extracţia ADN plasmidic
În cercetare plasmidele sunt utilizate pentru inserarea unor secvenţe care sunt multiplicate concomitent în celule gazdă (E.coli). Extracţia are ca scop separarea ADN plasmidic de cel al celulei gazdă. Tehnica cea mai frecventă include o etapă de liză alcalină în prezenţa de SDS în care cele două tipuri de acizi nucleici sunt denaturaţi. pH neutralizat rapid face ca ADN plasmidic să fie solubil iar cel cromozomial se transformă în agregat insolubil incluzând şi proteine denaturate şi SDS precipitat.

36 După centrifugare ADN plasmidic conţinut în supernatant, este precipitat cu etanol şi depozitul după centrifugare este eluat cu TE sau apă sterilă. Există numeroase variante. Utilizarea de cuarţ, răşini, agenţi haotropici şi kituri pe baza acestor procedee. Tehnica fenol/cloroform este adaptată extracţiei ADN plasmidelor. Extracţia ARN Eliberarea ribonucleazelor RNazele sunt ubicvitare şi dificil de inactivat, deoarece spre deosebire de ADNaze funcţionarea lor nu necesită cofactori.

37 Unele ţesuturi ca pancreasul, sunt foarte bogate în RNaze.
Deşi nu este posibil să le eliminăm, ele sunt capabile să se renatureze după supunerea la şoc termic. Totuşi după încăzire adaosul de βmercaptoetanol agent reducător, ajută la păstrarea RNazelor în stare denaturată împiedicând reformarea punţilor disulfidice. Este indispensabilă neutralizarea acţiunii lor în lizatul celular tratând proba cu detergenţi şi agenţi haotropici ca βmercaptoetanol şi tiocianat de guanidină.

38 În laborator sunt două surse de contaminare cu RNaze: mâinile operatorului şi germenii în suspensie din aer care se depun pe sticlărie şi consumabile. Deci este esenţial să se lucreze permanent cu mănuşi, să se utilizeze materiale de unică folosinţă, sticlăria să fie tratată cu dietilpirocarbonat (DEPC 0,1%) inhibitor puternic de RNază - apoi autoclavată ( DEPC intră în reacţie cu bazele purinice), fie să fie supusă la temperaturi foarte mari (200°C) la autoclav fără tratament cu DEPC. Materialul plastic este decontaminat cu sodă caustică 0,1 N şi EDTA 1 mM apoi spălat cu DEPC. Reactivii şi tampoanele trebuie tratate cu DEPC apoi autoclavate. Pentru tamponul TRIS nu se face autoclavare dar se utilizează apă tratată cu DEPC pentru prepararea tamponului. Apa deionizată este în principiu lipsită de ARNază.

39 Sunt necesare trei etape succesive pentru obţinerea ARN purificat.
1. Liza celulară. Se folosesc două grupe de detergenţi puternici care inhibă RNazele. În prima grupă agentul disociant utilizat este tiocianatul de guanidină (GTC) iar în a doua se asociază cu βmercaptoetanol. Ambii sunt inhibitori de RNază. Utilizarea combinată permite disocierea proteinelor liza celulelor, inactivarea RNazelor şi denaturarea ARN. Dacă se doreşte eliminarea riscului de contaminare ARN cu ADN este necesară tratarea cu DNază. Tehnica uneşte metode care necesită utilizarea fenolului şi a detergentului. Adesea se adaugă un inhibitor de RNaze /RNasin) izolat din pancreas de bovine. RNazele sunt de asemenea inactivate cu SDS, proteinaza K.

40 2. Extracţia propriu –zisă a ARN
ARN este extras cu fenol/cloroform. Separarea se face pe baza precipitării diferite a ARN şi ADN în funcţie de pH. În condiţii de pHacid ARN rămâne în soluţie apoasă. În mediu alcalin ADN rămâne în soluţie apoasă. 250µl material patologic (sange integral, ser, lichid de ascita) µl ARN µl cloroform in tuburi eppendorf de 1,5 ml; pentru fecale se dilueaza o cantitate de 1 ml apa D, se vortexeaza foarte bine, apoi se centifugheaza, iar lichidul clar se repartizeaza in tuburi si se prelucreaza la fel ; se agita foarte bine si se cenrifugheaza 15 minute / rpm, la +40C . Dupa centrifugare se observa aparitia a doua faze (una guanidinica la baza tubului si una apoasa, in care se gaseste ARN-ul)

41 in alt tub eppendorf de 1,5 ml se recolteaza cu atentie faza apoasa (lichid foarte clar), in cantitate aproximativa de 700µl ; peste aceasta se adauga 700µl izopropanol se introduc tuburile la congelator la -200C, unde se lasa pana a doua zi; se centrifugheaza 20 de minute / rpm, la +40C, dupa care se poate observa la fundul tubului, ARN-ul precipitat sub forma unui buton, cu o marime direct proportionala cu cantitatea de ARN din proba ;

42 se indeparteaza izopropanolul si se inlocuieste cu 1000µl etanol 60% si se centrifugheaza 20 minute la rpm, la +40C ; se indeparteaza toata faza lichida din tub, ramanand doar depozitul de ARN ; se introduce la termostat la 370C pentru uscare (10-15 minute), pana cand depozitul devine translucid ; se adauga 50µl apa distilata si se omogenizeaza foarte bine si se conserva la -800C .

43 Pentru determinarea concentratiei de ARN din proba se detemina densitatea optica (DO) a unui amestec ce contine 95µl apa distilata si 5µl ARN. Lungimea de unda la care se face citirea este de 260 nm. Formula dupa care se calculeaza cantitatea de ARN este urmatoarea : [ARN] = DO(260 nm) x 40 x 20 40 – factor de corectie 20 – dilutia Rezultatul se exprima in µg/ml . [ADNds] = DO(260 nm) x 50 x 20 50 – factor de corectie

44 Proba DO (260nm) Concentratia ARN (µg/ml) 43 0,067 53,6 44 0,064 51,2 45 0,186 148,8 45bis 0,116 92,8 46 0, 189 151,2 47 0,061 48,8 48 0,036 28,8 49 0,088 70,4 50 0,057 45,6 50 bis 0,100 80 51 0,055 52 53 0,053 42,4 53 bis 0,143 114,4 55 0,072 57,6 55bis 0,081 64,8 56 0,035 28 56bis 0,075 60 57 0,065 57bis 1 0,039 31,2 57bis 2 0,043 34,4 58 0,291 232,8 58bis 0,144 115,2 63 0,235 188 63bis 0,139 111,2 64 0,087 69,6 64bis 24 1 0,102 81,6 24 2 0,453 362,4

45 3.Precipitarea ARN. Se efectuează similar cu a ADN cu izopropanol sau etanol de asemenea se face spălare cu etanol 70%. ARN se mai poate obţine cu bile magnetice. Există numeroase kituri de extracţie rapidă. Dozarea ARN. Poate fi necesară în Northern blot, RNazin Protein Assey. Spectrofotometria. Este cea mai utilizată şi măsoară densitatea optimă la nm a unei diluţii de ARN.

46 Sinteza unui ADNc in vitro
Manipularea şi studiu ARN este diferită din cauza marii sensibilităţi la ribonucleaze care-l distrug. Este necesară recopierea secvenţei de ARN pentru a crea o structură stabilă şi care va fi amplificată în funcţie de necesităţi. ARNm purificat, utilizâd cromatografia prin afinitatea pe o coloană de oligodezoxitimidina, este legat în prima etapă cu oligonucleotide poliT care se ataşează la coada polyA. Pornind de la extremitatea 3 a acestei amorse poly T, transcriptaza inversă, care este o ADN polimerază, sintetizează un lanţ de ADN complementar al mesagerului de pornire

47 Odată ce s-a realizat această sinteză se degradează ARN printr-o bază tare sau o ribonuclează specifică. Lanţurile de ADN constituite formează spontan o buclă la extremitatea 3, sub forma de agrafă de păr, care se hibridează pe ea însăşi. Extremitatea 3 a acestei bucle va servi ca situs de demaraj pentru ADN polimeraza, care va sintetiza un lanţ de ADN complementar primei. O ribonuclează specifică ADN-ului monocatenar va suprima bucla la extremitate. ADNc dublu catenar este sintetizat. Se poate astfel constitui atât ADNc câţi ARNm există într-o celulă; ansamblul acestor ADNc formează o bancă de ADNc.

48

49

50 Electroforeza Electroforeza este o metoda de separare a particulelor incărcate electric prin migrare diferenţială sub actiunea unui câmp electric. Ne permite cuantificarea de manieră precisă a ADN şi ARN, iar în anumite cazuri, aprecierea cantităţii de acizi nucleici prezenţi (prin raportarea la un marker de talie cunoscută). Se poate utiliza hârtie, acetat de celuloza, gel de poliacrilamidă, gel de agaroză, gel de amidon, gel de siliciu. Există două tipuri de gel utilizate mai frecvent agaroză şi poliacrilamidă care permit o separare mai bună. Agaroza, polizaharid extras dintr-o varietate de algă roşie, este un polimer al unei unităţi dizaharidice; la încălzire în soluţii apoase formează hidrosoli, care la răcire se transformă în hidrogel.

51 Electroforeza în gel poliacrilamidă
Gelul de poliacrilamidă se formează prin polimerizarea vinilică a monomerilor de acrilamidă CH2=CH-CO-NH2 în lanţuri lungi de poliacrilamidă şi prin reticularea lanţurilor în urma includerii unui comonomer bifuncţional adecvat de obicei N, N’ metilen bisacrilamidă (Bis). CH2=CH-CO-NH-CH2- NH-CO-CH=CH2 Reacţia de polimerizare dă naştere în mod aleatoriu unor asemenea lanţuri de poliacrilamidă ce încorporează o mică cantitate de molecule Bis, acestea putând reacţioana cu alte grupuri ale altor lanţuri determinând reticularea şi formând o reţea. Concentraţia poliacrilică utilizată determină lungimea medie a lanţului de polimer, în timp ce concentraţia de Bis determină gradul de reticulare. Ambele concentraţii decid proprietăţile fizice ale gelului precum densitatea, elasticitatea , rezistenţa mecanică şi dimensiunile porilor.

52 În trecerea prin mediul de agaroză sau acrilamidă, moleculele se separă în funcţie de dimensiune.
Cele mai mari sunt reţinute, iar cele mai mici migrează. Acrilamida are putere mai mare separatoare decât agaroza însă este mai toxică. Tehnica electroforezei După formarea, turnarea gelului, trasarea godeurilor şi solidificarea acestuia se vor introduce probele de ADN. În primul godeu se introduce un marker cunoscut, care permite estimarea mărimii fragmentelor de ADN. Se utilizează frecvent ADN de fag restrictat cu o anumită enzimă. Fragmentele rezultate au o mărime cunoscută, ceea ce permite folosirea lor ca etalon. În godeurile rămase se introduc pe rând probele care urmează să fie analizate.

53 Se adaugă doi coloranţi: unul bine vizibil pe gel care va migra foarte rapid, albastru de bromfenol, pus înaintea fragmentelor de ADN pentru a delimita distanţa parcursă până la anod. Al doilea, bromura de etidiu, care se intercalează între bazele de acizi nucleici şi imprimă o culoare oranj când acestea sunt expuse la lumina UV. Astfel, moleculele de ADN complexate cu bromură de etidiu devin vizibile. Aparatul de electroforeză se cuplează la o sursă de curent . Polul pozitiv este opus godeurilor.Când frontul de migrare ajunge în apropierea capătului opus al gelului, se întrerupe sursa de curent. Se scoate tăviţa cu gel şi se vizualizează în UV la 254 nm, se vor fotografia fragmentele de ADN digerate în gel.

54 Distanţa de migraţie este proporţională masa moleculară: există o proporţionalitate inversă între mobilitatea şi logaritmul masei, dar relaţia este valabilă pentru moleculele liniare având sub 20 kb. Se determină astfel mărimea fragmentelor de restricţie obţnute şi se compară cu a celor de mărime cunoscută. migrarea moleculelor mari de 20kb este aproape independentă de mărime şi nu mai apare o relaţie de linearitate; conformaţia cerc deschis CD/OC - open circle, cerc covalent închis CCI/CCC – covalenty closed cirle. La aceeaşi masă moleculară, CCI au cea mai mare mobilitate pe când conformaţia CD este mai lentă. Moleculele liniare au o mobilitate intermediară. tamponul de electroforeză folosit este Tris Acetat (TAE).

55 După migrare probele se citesc la UV.
În unele cazuri moleculele care trebuiesc separate sunt marcate prin încorporarea unui izotop radioacitv care permite detectarea prin autoradiografie. Particulele energetice emise de radioizotop imprimă un film fotografic pe gel. Se developează pentru a se vedea benzile negre care corespund moleculelor marcate radioactiv. Efectele dimensiunii porilor În mediile gelificate, trecerea oricărei particule este întârziată de structura matricei şi depinde de mărimea relativă a particulelor şi a porilor din reţeaua gelului. Atât dimensiunile cât şi sarcina moleculelor au un rol important în procesul de separare. În gelurile de agar dimensiunea porilor este mare . Poliacrilamida are avantajul uşurinţei cu care mărimea porilor poate fi modificată prin concentraţia acrilamidei şi a proporţiei de agent de reticulare. Pe măsura creşterii proporţiei de agent de reticulare cinetica de reacţie este încetinită şi matricea de gel devine mai puţin omogenă.

56 Alegerea gelului şi a sistemului tampon adecvat
De exemplu un amestec de proteine virale sau acizi nucleici cu greutăţi moleculare mari ar putea impune alegerea unui gel cu pori mari având o concentraţie de poliacrilamidă T sub 5% pentru a evita efectul excesiv de sită moleculară. T=15-20% sau mai mult se pretează pentru polipeptide ori histone cu greutate moleculară mică, aceste concentraţii accentuând diferenţele minore de dimensiuni în cadrul aceluiaşi nivel de greutate moleculară. La separarea unui amestec de proteine este puţin probabilă alegerea acelui set de condiţii să poată garanta cel mai bun grad de separare a fiecărei componente de celelalte. Dacă într-un gel se obţine o singură bandă această nu conţine în sine dovada prezenţei unei singure componente omogene.

57

58 Gelurile plate verticale
Grosimea gelurilor 0,5-1,5 mm. Cu cât sunt mai subţiri cu atât sunt mai rapide şi eficiente pentru colorare, decolorare, iar răcirea din timpul electroforezei este mai rapidă şi mai uniformă. Aceasta permite aplicarea unei tensiuni mai mari şi a unor timpi de acţiune mai reduşi. Gelurile sunt obţinute în forme separate care ulterior sunt inserate în aparat cu ajutorul unor garnituri de cauciuc şi introduse în tamponul ce reprezintă mediul de răcire (răcire realizată prin mijlocirea tuburilor de apă). Un colorant trasor este albastru de bromfenol. Acesta migrează cu o viteză mai mare decât oricare dintre componententele macromoleculare ale probei şi indică momentul stopării electroforezei. Gelurile se introduc în baie de colorant cu bromură de etidiu 3 minute, apoi se examinează la o lampă cu ultraviolete.

59 Lipoproteinele, au caracter parţial proteic pot fi colorate înaintea electroforezei pentru a le deosebi de proteine. Se foloseşte Sudan Black B. Există densiometre laser care scanează gelurile la nivele de rezoluţie extrem de ridicată. Răspunsul scanner-ului poate fi computerizat ceea ce permite înregistrarea, redarea, evaluarea şi stocarea datelor pe disc sau imprimarea lor, precum şi compunerea a două geluri diferite. Semnalul densiometric este preluat pe un înregistrator şi este cuantificat prin măsurarea suprafeţelor de sub peak-urile individuale. Se poate recurge la integrarea electrică sau prin achiziţionarea de date pentru calcul computerizat al suprafeţelor de sub peak, metodă folosită pentru scanarea unui număr mai mare de geluri. Înălţimea peak-ului depinde de distanţa materialului parcursă prin gel.

60 Electroforeza proteinelor
Proteinele se pot separa prin electroforeză ca şi acizii nucleici. Suportul poate fi acetat de celuloză, pentru proteinele din serul uman, sau hârtie, într-un tampon de pH de 8,6. Benzile corespunzătoare proteinelor separate, sunt vizualizate prin colorare cu un colorant specific şi printr-o scanare densiometrică se obţin indicaţii despre cantitatea relativă a proteinelor din fiecare bandă separată. Deşi mobilitatea proteinelor depinde în special de sarcina electrică relativă a acestora, dimensiunea proteinelor joacă de asemenea un rol important şi aceasta contribuie desigur la poziţia benzii corespunzătoare moleculei de γglobulină.

61 Electroforeza proteinelor în gel de poliacrilamidă
Gelul de poliacrilamidă se poate folosi în locul acetatului de celuloză sau al hârtiei pentru separarea proteinelor native. Un astfel de gel este folosit în mod obişnuit în prezenţa dodecil sulfatului de sodiu (SDS). În acest caz proteinele oligomerice (alcătuite din câteva unităţi polipeptidice) se pot separa în subunităţile lor individuale. Proteinele se separă într-o soluţie SDS 1%. Acest detergent desface majoritatea legăturilor dintre proteine şi dintre acestea şi lipide. Pentru a desface şi punţile disulfurice, se adaugă foarte des şi 2-mercaptoetanol.

62

63 Mobilitatea electroforetică a majorităţii proteinelor (dar nu şi a glicoproteinelor), depinde de dimensiunea lor, deoarece sarcina negativă adusă de moleculele SDS legată de proteină este mult mai mare decât sarcina netă a proteinei însăşi. O distribuţie specifică (pattern) de benzi se obţine la colorarea gelului cu Albastru Comassie. Gelul de agaroză poate fi folosit în locul celui de poliacrilamidă în cazul proteinelor mai mari sau pentru a obţine o separare diferită în absenţa SDS. Se poate aplica metoda PAGE bidimensională, folosind condiţii de lucru diferite de cele două direcţii de migrare: de exemplu un gradient constant de pH (pH 4-7%) pe o direcţie şi un pH 11-14%poliacrilamidă în cealaltă direcţie.