Patofyziológia reaktívnych foriem kyslíka (ROS)

Παρουσίαση με θέμα: "Patofyziológia reaktívnych foriem kyslíka (ROS)"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Patofyziológia reaktívnych foriem kyslíka (ROS)
Ústav patologickej fyziológie Lekárska fakulta UPJŠ Košice Patofyziológia reaktívnych foriem kyslíka (ROS) František Ništiar

2 Voľné radikály a antioxidanty
Ako spoznáme voľný radikál? Reaktívne formy kyslíka a dusíka Sú voľné radikály vždy pohromou? Čo je oxidačný stres? Čo je antioxidant? Ktoré poznáme? Ako vieme oxidačný stres kvantifikovať? Ochorenia spojené s oxidačným stresom

3 objav trifenylmetyl radikálu Do 1950/60:
Ako sa to začalo Priestley: objav O2 pozorovanie toxických účinkov O2 Gomberg: objav trifenylmetyl radikálu Do 1950/60: minimálna pozornosť bola venovaná biologickým účinkom voľných radikálov a reaktívnych foriem kyslíka

4 Dôkaz o existencii ROS Gerschman et al. : Zistenie podobnosti medzi žiarením a toxicitou kyslíka McKord a Fridovich: Objav superoxid dismutázy a predpovedanie existencie endogenného superoxidu Babior et al.: Zistenie vzťahu medzi tvorbou superoxidu a bactericídnou aktivitou neutrofilov Granger et al.: Zistenie vzťahu medzi lokálnou tvorbou ROS a ischemicko-reperfúznym poškodením čriev

5 Voľné radikály majú jeden alebo viac nespárova-ných elektrónov na vonkajšom orbitály, majú symból []. Následkom toho majú zvýšenú reak-tivitu s inými molekulami. Táto reaktivita je daná tým, že môžu ľahko prijať alebo dať elektróny. Prevalencia kyslíka v biologických systémoch je to, kvôli čomu je kyslík centrálnym radikálom a má viacero bežných typov. O2 pôsobí v procesoch tak, že je stredobodom metabolizmu v aeróbnom živote, ako terminálny akceptor elektrónov sa redukuje na vodu. Prenos elektrónov na kyslík vedie k vzniku reaktívnych medziproduktov.

6 Čo je voľný radikál? O2•– molekula
Molekula, atóm, alebo ión schopný samostatnej existencie, ktorý obsahuje aspoň jeden nespárovaný elektrón radikál ión O2•– molekula

7

8 Superoxid - zdroje v tele
Únik elektrónov na kyslík dýchací reťazec v mitochondriách (1-2% celkovej spotreby O2) iné podobné redoxné systémy, napr. mikrozomálny cytochróm P450 monooxygenáza NAD(P)H oxidáza fagocyty (respiračné vzplanutie) nefagocytárne bunky Niektoré enzýmy xantínoxidáza cyklooxygenáza lipooxygenáza Reakcie FeII-hemoglobínu s kyslíkom Autoxidácia rôznych látok (askorbát, glutatión a iné tioly, katecholamíny)

9 O2•– Superoxid NO• + O2•–  OONO– (peroxynitrit) Vlastnosti: Osud:
neveľmi reaktívny, oxidačné aj redukčné činidlo obmedzená možnosť prestupu cez membrány (len cez aniónové kanály alebo vo svojej protónovej forme) uvoľňuje železo z Fe-S clusterov (zhlukov) Osud: dismutácia O2•– + O2•– + 2 H+  O2 + H2O2 reakcia s oxidom dusnatým NO• + O2•–  OONO– (peroxynitrit)

10 H2O2 Peroxid vodíka Tvorba v tele:
dismutácia superoxidu (spontánna alebo katalyzovaná superoxiddismutázou) O2•– + O2•– + 2 H+  O2 + H2O2 priamo činnosťou niektorých enzýmov: xantinoxidáza monoaminooxidáza (MAO)

11 H2O2 Peroxid vodíka Vlastnosti: Osud: nie je radikál
voľne prestupuje cez biologické membrány sám osebe je celkom nereaktívny ale rýchlo reaguje s redukovanými prechodnými kovmi ako železo a meď (Fentonova reakcia) Osud: Fentonova reakcia: hydroxylový radikál H2O2 + Fe2+  OH– + OH• + Fe3+ bezpečne odstránený glutatiónperoxidázou alebo katalázou

12 OH• Hydroxylový radikál H2O  H• + OH• Vznik v tele: Vlastnosti:
ionizačné rariadenia: H2O  H• + OH• Fentonova reakcia: hydroxylový radikál H2O2 + Fe2+  OH– + OH• + Fe3+ Vlastnosti: extrémne reaktívny. Poškodzuje biomolekuly blízko miesta svojho vzniku

13 NO• Oxid dusnatý Vznik v tele:
No syntázová reakcia: L-arginín + O2 + NADPH  L-citrulín NADP + NO• Tri rôzne NO syntázy: NOS I (neuronálna, koštitutívna) NOS II (fagocyty, induktabilná) NOS III (endotelová, konštitutívna

14 NO• Oxid dusnatý Vlastnosti: 4 NO• + O2 + 2 H2O  2 NO2– + 4 H+
plynný radikál reakcia s kyslíkom na dusitan (pomalá in vivo): 4 NO• + O2 + 2 H2O  2 NO2– + 4 H+ reakcia s hemovým železom hemoglobínu (…fyziologická inaktivácia): Hb-Fe2+-O2  Hb-Fe2+-OONO  Hb-Fe3+ + NO3– reakcia s hemovým železom guanylátcyklázy (…fyziologické účinky, relaxácia hladkého svalstva apod.): GC-hem-Fe2+ + NO•  GC-hem-Fe2+-NO

15 NO• Oxid dusnatý Vlastnosti (pokračovanie): NO• + GSH  GSNO + H+ + e–
reakcia so sulfhydrylovou skupinou glutatiónu atď. na nitrozotiol (…transport NO): NO• + GSH  GSNO + H+ + e– reakcia so superoxidom na peroxynitrit a konečne hydroxylový radikál (…toxicita): NO + O2•–  OONO– (peroxynitrit) OONO– + H+  HOONO  OH• + NO2• kys.peroxydusitá

16 Problémy sú na to, aby sme ich prekonali

17 V súčasnosti sa skôr používa termín reaktívne formy kyslíka (RFK, ROS) ako radikály kyslíka lebo singletový kyslík (jeden z foriem), hydro-xylová skupina, kyselina chlórna, peroxid, peroxid vodíka a epoxidové metabolity endogénnych lipi-dov a xenobiotík obsahujú funkčnú skupinu s re-aktívnym kyslíkom, ale nie sú radikály a nemusia reagovať s biologickými tkanivami radikálovými reakciami. Molekulový kyslík je biradikál, majúci dva ne-spárené elektróny stejného spinu. Ak je termi-nálnym akceptorom elektrónov redukuje sa na vodu, kyslík pôsobí v centrálnych metabolických procesoch aeróbneho spôsobu života.

18 Tvorba ROS

19 tripletový kyslík 3O excitácia O2 singletový kyslík e– superoxid •O2– H •HO2 hydroperoxyl e– peroxidový ión O22– H HO2– H H2O e– hydrogénperoxidový ión hypotetický produkt •O23– H H2O oxén •O– H •OH hydroxylový radikál e– oxid O2– H+ H2O

20 Tvorba reaktívnych foriem

21

22

23

24 Reaktívne formy kyslíka a dusíka (RONS)
ROS RNS Voľné radikály: Látky, ktoré nie sú voľné radikály: superoxidový anión O oxid dusnatý NO. hydroxylový radikál OH . oxid dusičitý NO2 . peroxyl ROO . alkoxyl RO . hydroperoxyl HO2 . peroxid vodíka H2O nitrozonium NO+ kyselina chlorná HClO nitroxyl NO– ozón O kyselina dusitá HNO2 singletový kyslík 1O oxid dusitý N2O3 oxid dusičitý N2O4 nitronium NO2 + peroxynitrit ONOO– alkylperoxynitrit ROONO

25 cytochróm c-oxidáza Reaktívne metabolity kyslíka Cytochrómová kaskáda
kaskáda (ROM cyklus) 4O2 4e- 4O2.- 2H2O2 + 2O2 2H2O O2 4O2 4e- 4O2- 4O22- 4O23- 4O24- 16H+ 8H2O XO v prítomnosti NADPHO cytochróm c-oxidáza SOD KAT 4O2 + 4H+ + 4e H2O + 3O O2 + 16H+ + 16e H2O (výťažok pre tvorbu ATP)

26 Polčas niektorých reaktívnych foriem
Reaktívne formy Polčas (s) Fyziol. konc. (mol/l) Hydroxylový radikál (OH) Alkoxylový radikál (RO) Singletový kyslík (1O2) Peroxynitritový anión (ONOO-) Peroxylový radikál (ROO) Oxid dusnatý (NO) Semichinónový radikál Peroxid vodíka (H2O2) Superoxidový anión (O2-) Kyselina chlórna (HClO) 10-9 10-6 10-5 0.05 – 1.0 7 1 - 10 minúty/hodiny spontán. hodiny/dni (urýchlené enzýmami) (urýchl. SOD na 10-6) Závisí od substrátu 10-9

27 Budeš reaktívny???

28 ROS prítomné v cicavčích tkanivách sú endogen-ného aj exogenného pôvodu. Ich tvorba je esenciál-na pre normálnu funkciu alebo metabolizmus väč-šiny cicavčích buniek. Približne 90% všetkého kyslíka sa spotrebuje bunkami za katalytickej redukcie štyrma elektrón-mi za zisku dvoch molekúl vody. Dnes už je jasné, že sa kyslík môže redukovať aj menším počtom elektrónov v enzýmových a neenzýmových reak-ciách. ROS sú, ale aj deštruktívne ak uniknú prísnej kontrole. Bunky majú vyvinuté batérie ochranných mechanizmov a molekúl na zabránenie a opravu poškodení vyvolaných oxidačným stresom.

29 Tvorba v organizme cicavcov
Pôvod ROS Tvorba v organizme cicavcov Zdroje endogenné exogenné synt. prostaglandinov radiácia, ultrazvuk dýchací reťazec fajčenie cigariet autooxidácia lieky VOĽNÉ RADIKÁLY fagocyty teplo oxyhemoglobín pesticídy oxidatívne enzýmy infekcie akumulácia reduk.metab. hyperoxia, záťaž fyz. polutanty vo vzduchu (NOx, O3) H+ .NO OONO HOONO NO2. e e e e- O O H2O OH H2O O O2 Fe2+ Fe3+ H+ Cl- Myelo- peroxidáza H2O HOCl O2 + Cl- H2O H2O

30 Odkiaľ pochádzajú voľné radikály?
Hlavný producenty ROS : membránovo viazané enzýmy popr. koenzýmy, flavínové štruktúry, hemové koenzýmy, enzýmy s Cu v aktívnom centre 1. respiračný reťazec mitochondrií : predevšetkým superoxid a následne H2O2 cca. 1- 4% O2 vstupujúceho do respirač. reťazca (hlavne komplexy I a III)

31

32 Odkiaľ pochádzajú voľné radikály? II
2. endoplazmatické retikulum vznik superoxidu (cytochróm P- 450) 3. špecializované bunky (leukocyty, makrofágy) produkcia superoxidu NADP-oxidázou 4. Oxidácia hemoglobínu na methemoglobín (erytrocyt je „nabitý“ antioxidantmi)

33 Skúsme svoje závity preorientovať na riešený problém

34 Funkcia voľných radikálov v zdravom organizme
Nástroj oxidáz a oxygenáz cytochrómoxidáza (toxické medziproduk-ty, H2O2 a superoxid, viazané na enzýme) monoxygenázy (oxygenázy so zmiešanou funkciou) - aktivujú O2 v ER pečene alebo v mitochondriách nadobličiek; hydroxylácia

35 Funkcia voľných radikálov v zdravom organizme II
ROS a RNS proti bakteriám enzýmový komplex NADPH-oxidáza leukocytov a makrofágov myeloperoxidáza - katalýza reakcie H2O2 + Cl- + H+ = HClO + H2O

36 Funkcia voľných radikálov v zdravom organizme III
signálne molekuly primárny posol  sekundárny posol  info sieť redoxný stav bunky ovplyvňuje funkciu tejto siete redoxný stav: kapacita antioxidačného systému, dostupnosť redukčných ekvivalentov, intenzita oxidačnej záťaže (RONS)  ROS: sekundárny posly

37 Imunitná ochrana vs. regulácia
masívna produkcia ROS ako nástroj imunitnej ochrany x indukcia zmien nízkych koncentrácií ROS, ktoré sú pravdepodobne regulačným mechanizmom

38 Enzymatické zdroje ROS
Xantínoxidáza hypoxantín + 2O2 ® xantín + O2.- + H2O2 NADPH oxidáza NADPH + O2 ® NADP+ + O2.- Amínooxidáza R-CH2-NH2 + H2O + O2 ® R-CHO + NH3 + H2O2 Myeloperoxidáza tvorba per...oxokyseliny H2O2 + X- + H+ ® HOX + H2O NADH oxidázová reakcia Hb(Mb)-Fe3+ + ROOH ® zlučenina I + ROH zlučenina I + NADPH ® NAD· + zlučenina II zlučenina II + NADH ® NAD· + E-Fe3+ NAD· + O2 ® NAD+ + O2.- Aldehydoxidáza 2R-CHO + 2O2 ® 2R-COOH + O2.- Dihydroorotát dehydrogenáza dihydroorotát + NAD· + O2 ® NADH + O2.- + kyselina orotová

39 Neenzymatické zdroje ROS a autooxidačné reakcie
Fe2+ + O2 ® Fe3++ O2.- Hb(Mb)-Fe2+ + O2 ® Hb(Mb)-Fe3++ O2.- katecholamíny + O2 ® melanín + O2.- Redukovaný flavín leukoflavín + O2 ® flavín semichinón + O2.- Koenzým Q-hydrochinón + O2 ® koenzým Q (ubichinón) + O2 .- tetrahydropterín + 2 O2 ® dihydropterín + 2 O2.-

40 Kosť je predsa kosť, radikál len radikál

41 Do 1960s, voľné radikály neboli považované za dôležité pre fyziológiu a patofyziológiu cicavčích buniek. Objavy existencie superoxid dismutázovej (SOD) aktivity v cicavčích bunkách v 1969 McCord a Fridovich; súvislosť baktericídnej aktivity neutrofilov s tvorbou superoxido-vého radikálu (O2.-) Babior a spol. 1973; spojitosť voľných radikálov s početnými fyziologickými a patofyziologickými proces-mi. O dekádu neskôr, 1981, Granger a spol. postavili hypotézu o úlohe týchto reaktív-nych foriem v reperfúznom poškodení po črevnej ischémii.

42 Funkcia RONS v zdravom organizme
fagocyty (likvidácia infekčných agens) funkcia signálnych molekúl (ovplyvnenie napr. syntézy cytokínov, regulátorov proliferácie ai.) účasť na uvoľňovaní a premene energie (dýchací reťazec) súčasť enzýmových mechanizmov (dýchací reťazec - oxidázy, hydroxylácia endogenných látek a xenobiotík - oxygenázy)

43 Neenzýmové antioxidanty: transferín, kyselina močová, albumín, etc.
ROS sú prísne kontrolované výsledkom čoho je rovnováha medzi ich tvorbou a elimináciou ROS: O2, H2O2 , 1O2 OH, HClO Enzýmy: SOD (c, m) , GPX (c, m), CAT (c, p) Neenzýmové antioxidanty: vitamíny (E,A,C), tioly, fenoly, ceruloplazmín, transferín, kyselina močová, albumín, etc. c-cytozolový, m-mitochondriálny, p-peroxizomálny

44 Biologické antioxidačné ochranné mechanizmy
Ochranné mechanizmy v organizme a. Katalitické odstraňovanie voľných radikálov O spontánna dismutácia - superoxid dismutáza (SOD) - ceruloplazmín H2O2 - glutation peroxidáza (GTPx) - kataláza (CAT) Organické hydroperoxidy - GTPx Disulfidy - GTPx Oxidovaný askorbát - GTPx b. Zhášače voľných radikálov (antioxidanty) Vitamín E (-tokoferol) O2.-, .OH, LPO Redukovaná kyselina askorbová pri vysokých koncentráciách O2.-, .OH, LPO nízko m.w. tioly (napr. cysteín) vysoko m.w. tioly (napr. albumín) c. Odstránenie Fe a Cu Feritín, transferín, laktoferín (Fe) Ceruloplazmín (Cu, Fe) Sérový albumín (Cu) O2.- LPO Superoxid dismutáza (Cu/Zn-Mn) Vitamín E Fe3+ Fe2+ .OH H2O2 Feritín Kataláza GSH GSH-peroxidáza GSSG H2O H2O + O2

45 Za patologických podmienok je biologická rovnováha porušená
Enzýmy: SOD,GPX,CAT Neenzýmové antioxidanty: vitamíny (E,A,C), tioly, kyselina močová, ceruloplazmín, transferín, fenoly, albumín, etc. ROS: O2, H2O2 , 1O2, OH, HOCl Následky uvedené na ďalšom obrázku

46 To je rovnováha!!!!!!! Drží jú dobre

47 Porucha rovnováhy medzi tvorbou a elimináciou ROS sa vyvinie počas zápalu, ischémii/reperfúzii, porušenom metabolizme, účinku liekov, polutan-tov a pod., Takéto poruchy rocnováhy vedú k poškodeniu mozgu, srdca, ciev, čriev, dýchacích ciest, svalov, parenchymatóznych orgánov (pečeň, obličky, pankreas), očí, kože, kĺbov, etc. Expozícia tkanív s ROS v rôznych biologických systémoch bola dokumentovaná ich schopnosťou poškodiť lipidy, proteíny a DNA. Výsledné poškodenie je potencované zvýšením voľného intracelulárneho Ca2+ spôsobujúceho aktiváciu/ dezaktiváciu rôznych enzýmových systémov a bunkového poškodenia a smrti.

48 Mechanizmy ROS ktoré indukujú bunkové poškodenie
Peroxidácia Oxidácia tiolov poškodenie DNA Schiffové bázy lipidov tvorba karbonylu Poškodenie transportných Poly ADP Expresia systémov Ca2+ a iných iónov ribozylácia poškodeného génu Amadoriho produkty Poškodenie Instabilita na udržanie Deplécia ATP membrán normálneho gradientu iónov a NAD(P)(H) Aktivácia/dezaktivácia AGEs rôznych enzýmových systémov (Advanced glycation end products) Poškodenie bunky LIPIDY PROTEÍNY DNA CUKRY

49 oxidačný stres Oxidačný stres
Pri porušení rovnováhy medzi vznikom a odstraňovaním RONS nastáva tzv. oxidačný stres Rovnováha môže byť porušená na oboch stranách!!!

50 Poškodenie DNA Poškodenie štiepenie cukorného kruhu modifikácia báz
zlomy reťazca Dôsledok mutácia translačné chyby inhibícia proteosyntézy

51 DNA je poškodzovaná reaktivnými metabolitmi kyslíka a dusíka
Hydroxylový radikál – vysoko účinný a neselektivný: 1. reaguje s deoxyribózou (odoberá vodíky) – vzniká malondialdehyd a ďaľšie produkty Dôsledky – deštrukcia sacharidov a prerušenie reťazca. To vedie k aktivácii PARP (poly(ADP-riboza)polymerázy - enzýmu viazaného na chromatín, ktorý využíva NAD+ k náprave zlomov). Nadmerná aktivácia PARP = deplécia NAD+ = interferencia so syntézou ATP = bunková smrť. 2. pripojuje sa k purínovým a pyrimidínovým bázam – mení ich na hydroxyderiváty a oxoderiváty Dôsledok – chybné párovanie báz pri replikácii DNA a zavedenie chyby do genetickej informácie Singletový kyslík – negeneruje reťazcové zlomy, reaguje hlavne s guanínom Produkty LPO (RO*, ROO*) môžu poškodzovať DNA Reaktívne metabolity dusíka Môžu spôsobiť nitráciu alebo deamináciu báz DNA

52 Dôsledky oxidatívneho poškodenia
Modifikácia báz vedie k mutáciám. Príklad: RNS deaminujú A na HX, C na U a G na X, čo má za následok nesprávne párovanie báz (napr. správne párovanie A – T je nahradené HX – C)

53 V organizme prebieha: Neenzýmová LPO
Neenzýmová LPO Prebieha popísaným spôsobom – reakciou s voľnými radikálmi. Dáva zmes rôznych produktov: Etán, pentán – vydychujeme pľúcami malondialdehyd (MDA), 4-hydroxynonenal (HNE) sa naväzujú na proteíny a menia ich životnosť a funkciu. Enzýmová LPO Prebieha na aktívnych centrách hydroperoxidáz a endoperoxidáz (cyklooxygenáza, lipoxygenáza) a produkuje biologicky aktívne látky dôležité v riadení biologických dejov. Voľné radikály nie sú v tomto prípade uvoľňované z enzýmov, a tak neškodia.

54 Často diskutovaná otázka
Sú prospešnejšie nasýtené alebo nenasýtené mastné kyseliny ? Odpoveď nie je jasná. Sú prospešnejšie ω 3 alebo ω 6 mastné kyseliny ? Grónski Eskymáci – veľmi nízka frekvencia srdcových ochorení, psoriázy, sklerózy multiplex – predpoklad, že je to spôsobené ω 3 mastnými kyselinami v rybom tukom. Štúdiá s podávaním rybieho tuku ako protektíva alebo liečiva nie sú presvedčivé. Možný dôvod: ω 3 mastné kyseliny v rybom tuku peroxidujú veľmi ochotne (vždy 20-30% predávaného rybieho tuku je peroxidované).

55 Ja diskutujem zriedka, ale vecne...

56 Glykácia a glykooxidácia
Glukóza v roztoku existuje v nealdehydickej kruhovej forme, čiastočne však aj v rovnom reťazci tvoriacom aldehyd. Aldehydy sú chemicky reaktívne a môžu sa viazať na aminoskupiny proteínov v procese nazývanom neenzymatická glykácia. Vzniká tzv. Schiffova báza. Zvýšená hladina glukózy v krvi vedie k patologickej hladine glykácie.

57 Po určitej dobe sa Schiffové bázy preusporiadajú.
Vzniká Amadoriho produkt. Ten sa ďalej počas týždňov až mesiacov mení na konečné produkty pokročilej glykácie = Maillardovú zlúčeninu alebo advanced glycation end products (AGE). AGE sa môžu oxidovať kyslíkom za vzniku superoxidu ako aj ďaľších ROS. Glykáciu teda doprevádza glykooxidácia a oxidačný stres.

58

59 Glykácia mení vlastnosti modifikovaných proteínov
Príklady negatívneho pôsobenia glykácie: inaktivace SOD = zvýšený oxidatívny stres glykácia apoB v LDL = zmena náboja LDL částice a jej väzba na scavenger LDL receptory makrofágov AGE sú rozpoznávané špecifickými receptormi na povrchu endotelových a imunitných buniek a následne ovplyvňujú transkričné faktory a expresiu genov terčových buniek AGE zvyšujú syntézu adhezívnych molekúl na endotely ciev. Podporujú adhezivitu monocytov a ich prienik do cievnej steny. Tým podporujú vznik aterosklerózy. Zmeny v antigenicite (autoimúnne reakcie)

60 Proteíny = významný terč voľných radikálov
Celý rad aminokyselín je hydroxylovaných hydroxylovým radikálom a nitrovaných peroxynitritom (tryptofán, fenylalanín, tyrozín) S proteínmi reagujú aj alkoxylové a peroxylové radikály vznikajúce pri LPO

61 Dôsledky poškodenia proteínov
Zmena enzymatickej aktivity Zmena iónovej homeostázy bunky (porucha funkcie transportných pump) V cytozole sa hromadí Ca2+  aktivácia proteáz a fosfolipáz Vznik nových antigénnych determinant a nástup autoimunitných reakcií Zmeny v molekulárnej bunkovej signalizácii

62 Poškodenie proteínov Poškodenie agregácia a sieťovanie,
fragmentácia a štiepenie reakcia s hémovým železom modifikácia funkčných skupín Dôsledok zmeny transportu iónov zmeny aktivity enzýmov proteolýza

63 Poškodenie lipidov - atak na nenasýtené MK
strata násobných väzieb vznik reaktívnych metabolitov (aldehydy) Dôsledok zmena fluidity priepustnosti membrán vplyv na membránovo viazané enzýmy

64 Peroxidácia lipidov Tuky a oleje pri skladovaní na vzduchu žltnú
Tuky a oleje pri skladovaní na vzduchu žltnú (autooxidačná radikálová reťazová reakcia) V biologických systémoch tomuto procesu podliehajú PUFAs, tj. polynenasýtené mastné kyseliny s viacerými dvojitými väzbami

65 Peroxidácia lipidov

66 Tri fázy lipidovej peroxidácie Prvá fáza = iniciácia
Prvá fáza = iniciácia Hydroxylový radikál HO*, alkoxylový radikál RO* a peroxylový radikál ROO* Každá z týchto látok dokáže vytrhnúť vodík z metylénovej skupiny reťazca mastnej kyseliny. Mastná kyselina alebo lipid se tak stáva uhlíkovým radikálom (-*CH-)  LH + HO*  L* H2O Druhá fáza = propagácia Po vytrhnutí vodíka s elektrónmi v uhľovodíkovom reťazci mastných kyselin sa usporiadajú tak, že medzi dvoma dvojitými väzbami je jedna väzba jednoduchá (= konjugovaný dién). Tieto látky reagujú s molekulárnym kyslíkom za vzniku peroxylového radikálu (LOO*)  L* + O2  LOO* LOO* je schopný vytrhnúť elektrón z mastnej kyseliny susedného lipidu, který sa tak stáva novým radikálom, zatiaľ čo LOO* sa premení na hydroperoxid (LOOH). LH + LOO*  L* LOOH Tretia fáza = terminácia Radikálová reakcia sa v lipidoch propaguje, pokiaľ sa radikál PUFA nestretne s iným radikálom alebo s vitamínom E, kedy sa reťazová reakcia ukončí vznikom stabilnej zlúčeniny (terminácia).

67 Výsledkom lipidovej peroxidácie sú:
Hydroperoxidy mastných kyselín Cyklické endoperoxidy mastných kyselín Tieto peroxidy sú pomerne stabilné, pokiaľ sa nestretnú s prechodnými kovmi, ktoré kataly-zujú Fentonovu reakciu. V nej sa lipidové peroxidy menia na alkoxylové radikály LO* a hydroxidový anion OH -.    LOOH + Fe (II) [alebo Cu (I)]  LO* + Fe (III) [alebo Cu (II)] + OH -

68

69 ROS v apoptóze NOXA (trauma, hypoxia pod homeostatickou
metabolická insuficiencia kontrolou do určtej aktivácia excitačných receptorov) hranice Disbalancia iónov kaspáza/calpain tvorba ROS zlýhanie mitochondrií aktivácia Bcl-2 / Bax disbalancia BUNKOVÁ SMRŤ (nekróza/apoptóza)

70 Vieme, že voľné radikály majú vzťah k rôznym poruchám zdravia.
Sú rôzne patologické podmienky kde zohrávajú dôležitú úlohu extracelulár-ne aj intracelulárne ROS. Ajkeď sa to intenzívne študuje, ostáva ešte veľa nezodpovedaných otázok o voľných radikáloch a ROS.

71 Patologické podmienky, pri ktorých pôsobia voľné radikály a miesta účinku ROS
Hypo-, hyper-oxygenácia a reperfúzie po ischémii Imunitné reakcie kataraktogenéza Radiačné poškodenie Chemickíá kancerogenéza VOĽNÉ RADIKÁLY starnutie a senilná demencia nádor Diabetes Ateroskleróza Parkinsonizmus Fe, lieky a chemická toxicita fajčenie, polutanty a liekmi vyvolané reakcie zápalové reakcie intracelulárne extracelulárne Intracelulárne a extracelulárne

72 Tvorba ROS počas ischémie a reperfúzie
ATP I S AMP Xantín dehydrogenáza C H Adenozín É Ca2+ proteázy M Inozín A Hypoxantín+Xantín oxidáza O2.- aktivované chemoattraktanty REOXYGENÁCIA Cl- H2O O Extravazované Cirkulujúce neutrofily neutrofily MPO Fe Fe3+ Aktivátory HOCl OH neutrofilov Chemoattraktanty Poškod. tkanív

73 ROS v sekvencii udalostí pri mŕtvici
HYPOXIA ATP deplécia Depolarizácia buniek ( Mg blokuje NMDA rek.) Uvoľnenie excitačných aminokyselín Ca2+ influx do buniek Pomalá akumul. Ca2+ v mitochondriách Aktivácia fosfolipáz, MPT póry otvrené v mitochondriách proteínkinázy, proteázy, kolaps gradietu H+ v mitochondriách endonukleázy, fosfatázy etc. vznik ROS vznik ONOO- Devastatorický účinok v bunkách NEURONÁLNA SMRŤ Terapeutické intervencie: cyklosporín (špecifický inhibítor MPT pórov), antioxidanty (lazaroidy, deferoxamín, SOD v lipozómoch, allopurinol)

74 Časté terče ROS resp.trakt črevá srdce a cievy mozog a nervy HOCl OH

75 …a predsa nie je úplne guľatá!!!!!

76 ROS účinkujú odlišne na jednotlivé tkanivá a zložky tkanív.
Účinkujú okrem hladkosvalových buniek aj na epitel, endotel, inerváciu, membránové lipidy, receptory, transmitérové systémy, tvorbu prostanoidov, homeostázu Ca2+, etc.)

77 Mechanizmy účinku ROS na respiračný trakt
Fyziologické podmienky Patologické podmienky O2.- O2.- Bez zmien Dominuje kontrakcia H2O2 H2O2 dlhotrvajúca kontrakcia Dominuje kontrakcia .OH .OH intenzívna kontrakcia Dominuje relaxácia Diameter trachey Diameter trachey kľudový tonus Iniciálna zmena tonusu po ROS Pozdná zmena tonusu po ROS epitel kľudový tonus Iniciálna zmena tonusu po ROS Pozdná zmena tonusu po ROS hladký sval SOD- superoxid dismutáza; Cat – kataláza; LMWAO – nízko mol.hmotnostné antioxidanty

78 NO reaguje s O2- za vzniku nestabil-ného peroxynitritu, ktorý sa rozloží na tiež veľmi toxický OH. Nakoľko sú veľké energetické prírastky pri redukcii OH na H2O, tento radikál reaguje okamžite s každou biologickou molekulou v svojom bezprostrednom prostredí odovzdaním atómu vodíka.

79 Tvorba ROS v endotele a neutrofiloch
OONO- OH L-arginín NOS O NADPH NO ATP AMP adenozín inozín hypoxantín O2 XDH XO kys. močová O2- OH H2O2 O2 NO n e u t r o f i l NADPH NADPH oxidáza e n d o t l O2- NADP+ H2O2 OH MPO MPO HClO

80 Účinky ROS na endotel a rozvoj aterosklerózy
aterosklerotická lézia proliferácia buniek uvoľnenie rastových faktorov aktívny kyslík, nahromadenie kolagenáza, elastáza, adherencia makrofágov lipázy, proteázy trombocytov Plazma endoteliálne bunky LDL Intima aktivovaný kyslík fatty Streak Fe/Cu Oxidatívne modifikovaná LDL apoB-viazaný 4-hydoxynonenal, oxidované lipidy, hydroperoxidázy mastných kyselín monocyt poškodenie membrány tkanivové makrofágy monocyt Penové bunky

81 Choroby ktoré môžu mať ROS patogenézu I
Respiračný trakt Normobarické hyperoxické poškodenie Bronchopulmonárna dysplázia Idiopatická fibróza pľúc Respiračný distres syndrómy (ARDS, IRDS) Emfyzém Chronická bronchitída a asthma bronchiale Asbestosis Inhalované polutanty, dym, chemikálie (napr. paraquat, bleomycín) a oxidanty (napr. SO2, NOx, O3) Črevá Ischémia/reperfúzia Crohnova choroba Ulceratívna kolitída a nekrotizujúca enterokolitída Žalúdkové a duodenálne vredy Chemikálie (napr. NSAID)

82 Na črevné problémy????? …sebavedomie ale vylepšuje!!!

83 II Srdce a cievy Mozog a nervy Chemikálie (napr. etanol, doxorubicín)
Ischémia/reperfúzia (po infarkte, transplantácia) Chemikálie (napr. etanol, doxorubicín) Ateroskleróza/hypertenzia Deficiencia selénu Vasculitis Mozog a nervy Hyperbaricko hyperoxické počkodenie Parkinsonova choroba Alzheimerova choroba Amyotrofická laterálna skleróza Neuropatie (napr. diabetická) Neurotoxíny (napr. 6-hydroxydopamín, MPTP) Deficiencia vitamínu E Neuronálna ceroidná lipofuscinóza Traumatické poškodenie/hemorágie/zápal Ischémia/reperfúzia HIV-demencia Mnohopočetná skleróza

84

85 ALZHEIMEROVA CHOROBA a oxidatívny stres
 oxidácia proteínov (karbonyly) - „krížové väzby“  Fe v neurónoch s fibrilárnymi agregátmi (-hyperfosforly.proteín)  obsah Al v neurónoch s fibrilárnymi agregátmi tvorba -amyloidu (priamy cytotoxický účinok,  Cai, tvorba ROS aj v neprítomnosti Me2+)  aktivita mikroglie (mozgové makrofágy = zdroje ROS)  aktivita CAT bez  aktivity SOD následkom  H2O2 a OH tvorba lipidových hydroperoxidov a reaktívnych cytotoxických aldehydov (napr. HNE) Terapeutické intervencie: antioxidanty a zhášače ROS (napr. U-74500A, U-78517F, U-83836E, vitamíny E,C), chelátory, CAT, deprenyl

86 III Krv Chemikálie (napr. fenylhydrazín, primakvín, sulfonamidy, Pb) Fotooxidácia protoporfyrínu Malária Anémie (kosáčikovité bunky, favizmus) Pečeň Ischémia/reperfúzia Chemikálie (napr. halogénované uhľovodíky, chinóny, etanol, acetaminofén) Akumulácia železa alobo medi Endotoxín Obličky Autoimúnna nefróza (zápal, napr. glomerulonefritída) Chemikálie (napr. aminoglykozidy, ťažké kovy)

87 IV Pankreas Oči Koža Akútna a chronická pankreatitída
Diabetes mellitus Oči Prematuritná retinopatia Svetelná retinopatia Katarakty Laserová fotoablácia Koža Radiácia (slnečné, ionizujúce) Termálne poškodenie Chemikálie (fotosenzitizéry, napr. tetracyklíny) Kontaktná dermatitída Porfýria

88 V Svaly Iné Svalová dystrofia Mnohopočetná skleróza Fyzická záťaž
Starnutie Tehotenstvo a novorodenecké komplikácie Radiačné poškodenie Nádory Chemikálie (napr. alloxán, predávkovanie železa, rádiosenzitizéry) Autoimunitné choroby (napr. Reumatoidná artritída, lupus erythematosus) Zápal (vo všeobecnosti)

89

90 Antioxidačný ochranný systém
Tri typy ochrany zábrana tvorby nadmerného množstva RONS záchyt a odstránenie radikálov (lapače, vychy-távače, zhášače) reparačné mechanizmy poškodených biomolekúl

91 Prehľad antioxidantov a vychytávačov ROS
1. Endogenné antioxidanciá enzýmové (cytochróm c, SOD, GSHPx, kataláza) neenzýmové - membránové (-tokoferol, -karotén, koenzym Q10) - nemembránové (askorbát, uráty, transferín, bilirubín)

92 Prehľad antioxidantov a vychytávačov ROS II
2. Exogenné antioxidanciá inhibítory vzniku VR (regulácia aktivít enzýmov) scavengery vzniklých VR (enzýmy, neenzýmy) stopové prvky (Se, Zn)

93 Superoxiddismutáza (EC 1.15.1.1, SOD) 2 O2. - + 2 H+  H2O2 + O2
SOD - takmer vo všetkých aeróbnych organizmoch tri druhy - rôzne kofaktory (vždy metalický atóm) indukcia pri vyššej tvorbe superoxidu

94 Superoxiddismutáza Mn2+ SOD (SOD1) tetramér matrix mitochondrií
menšia stabilita ako Cu,Zn - SOD fylogeneticky mladšia

95 Superoxiddismutáza Cu2+/Zn2+ SOD (SOD 2) dimér, Cu = redoxné centrum
cytozol, intermitochondriálny priestor hepatocyt, mozog, erytrocyt vysoká stabilita, katalýza pri pH 4,5-9,5

96 Glutationperoxidázy odstraňujú intracelulárne hydroperoxidy a H2O2
2 GSH + ROOH  GSSH + H2O + ROH cytozolová GSH - glutationperoxidáza (EC , cGPx) extracelulárna GSH - glutationperoxidáza (eGSHPx) fosfolipidhydroperoxid GSH - peroxidáza (EC , PHGPx)

97 Kataláza (EC 1.11.1.6, KAT) 2 H2O2  2 H2O + O2
inaktivácia H2O2 : peroxizómy a mitochondrie hepatocytov, cytoplazma erytrocytov tetramér obsahujúci Fe, prítomnosť NADPH

98 Vysokomolekulárne endogenné antioxidanty
transferín laktoferín feritín haptoglobín hemopexín ceruloplazmín albumín chaperóny

99 Nízkomolekulárne endogenné antioxidanty I
Askorbát (vitamín C) syntéza kolagénu premena dopamínu na noradrenalín redukčné činidlo vstrebávanie železa antioxidačný účinok = redukcia O2 · - , OH ·, ROO·, HO2 · regenerácia tokoferylového radikálu prooxidant -tokoferol a vitamín E antioxidanty membrán produkujú hydroperoxidy, ktoré zneškodňuje GSHPx

100 Kyselina askorbová a jej metabolity

101 Nízkomolekulárne endogenné antioxidanty II
ubichinon (koenzým Q) prenášač elektrónov v dýchacom reťazci tlmí radikálové reakcie v spolupráci s tokoferolom karotenoidy, -karotén, vitamín A odstránenie radikálov v lipidoch

102 Nízkomolekulárne endogenné antioxidanty III
glutation (GSH, GSSG) vo všetkých cicavčích bunkách (1-10 mmol/l) významný redox pufer 2 GSH  GSSG + 2e- + 2H+ likviduje ROS, stabilizuje v redukovanej SH- skupine, regeneruje tokoferyl a askorbát substrát glutathionperoxidáz

103 Nízkomolekulárne endogenné antioxidanty IV
kyselina lipoová (lipoát) kofaktor PDH regenerácia tokoferylu, askorbátu melatonín hormón hypofýzy (regulácia spánkového cyklu) lipofilný; vychytávač hydroxylových radikálov

104 Nízkomolekulárne endogenné antioxidanty V
kyselina močová (urát) - odpadová látka? nejhojnejší antioxidant plazmy, významná reabsorpcia, vychytávanie RO. , HClO, väzba Fe, Cu bilirubín - inhibícia lipoperoxidácie flavonoidy - chelatácia Fe, antikarcinogénne a protizápalové účinky

105 To teda antioxidant je dobrý…..

106 Stopové prvky ovplyvňujúce ROS
Selén ovplyvňuje resorpciu vit. E, súčasť selenoproteínov  Se = nedostatočná imunitná odpoveď, hemolýza erytrocytov, syntéza MetHb Zinok stabilizácia bunkových membrán, zvýšenie imunitnej odpovede, antagonista Fe

107 Potenciálna antioxidačná terapia I
Inhibítory syntézy ROS Inhibítory NADPH-oxidázy Flavoproteínové inhibítory (FAD analóga, protilátky proti cytP450 reduktázy) Látky tvoriace komplexy s Fe2+ v cyt b (butylizokyanid, imidazol, pyridin) Mg2+(schopné väzby s FAD), Fe2+ ,Cu2+ chelátory (batofenantrolín, EDTA, EGTA, deferoxamín, bilirubín) Tiolové reagenty (N-etylmaleimid, 1-naftol, 1,4-naftochinón) NADPH analóga (NADPH 2,3-dialdehyd) Inhibítory metabolizmu AA a PLA2 IMAO (Deprenyl) Iné (kortikosteroidy, difenyliodonium) Inhibítory xantínoxidázy (wolfrám, oxypurinol, allopurinol, pterinaldehyd, kyselina listová) Antileukocytárne protilátky

108 II Látky podporujúce a doplňujúce enzymatické protektívne systémy
Superoxid dismutáza (SOD) SOD (Lip-SOD,PEG-SOD) diizopropylsalicylát meďnatý SOD mimetiká Kataláza (Cat) Cat (Lip-CatTP, Peg-CatTP) Glutationperoxidáza (GTPx) GSH, GSH metylester, GSH dietylmaleát nízko m.w. tioly (napr. cysteín) vysoko m.w. tioly (napr. albumín) L-2-oxotiazidolidin-4-karboxylát N-acetylcysteín Ebselen selén Laktoperoxidáza a DT-diaforáza

109 Látky interferujúce s metabolizmom Fe a Cu
III Látky interferujúce s metabolizmom Fe a Cu (deferoxamín, hemopexín, feritín, transferín, laktoferín, ceruloplazmín, sérový albumín) Antioxidanty Vitamíny a ich analogá (vitamín E, vitamín C, karotenoidy, oxykarotenoidy) Deriváty fenolu (eugenol, guajakol, probukol, N,N-difenyl- fenyléndiamín) Deriváty falónu (flavonoidy, izoflavonoidy, alirazín, green tea) Deriváty indolu (stobadín, karvedilol, melatonín, -karbolíny) Deriváty xantínu (allopurinol, oxypurinol, kyselina močová) 21-amino steroidy (lazaroidy) Protizápalové lieky (piroxikam, kyselina flufenamová, hydro- chinón, sulindak, fenylbutazón, indometacín, ibuprofén, naproxén, levamizol, sulfasalazín, kys. acetylsalicylová) Hypolipidemiká (lovastatín) Proteíny (albumín)

110 IV Látky obsahujúce síru (cysteín, cysteamín, GSH, ditiotreitol, N-acetylcysteín, ACE inhibítory, dimetyltiomočovina, tiourea, tiomalát, hypotaurín, taurín, penicilamín, 2-amino-2-tiazol, dihydrolipoát, a-merkaptopropionyl glycín, N-2-merkaptopropionyl glycín, b-merkaptoetanol, D,L-metionín, iné nízko a vysoko m.w. tioly) Nitrozo zlúčeniny ( .NO, nitrozopín) Iné lieky (b-adrenolytiká, H2-antihistaminiká, blokátory Ca-kanálov, pentoxyfylín, karbanyláty, močovina, bilirubín, glukány, manitol, glukóza, 2-metylaminochro-many, DMSO, BHT, BHA, 2-MEA, etoxykvín, kyselina a-lipoová, Zn2+)

111 V Inhibícia tvorby O2.- Nesteroidné antiflogistiká Antiasthmatiká
(b-adrenomimetiká, kortikoidy, metylxantíny) Prostaglandíny Flavonoidy Antibiotiká (napr. minocyklín) Antimalariká InhibítoryCE Dipyridamol

112 VI/a Zhášače alebo odstraňovače ROS Zhášače natvoreného O2.-
Flavonoidy a iné prírodné produkty Vitamíny E, C, A(-karotén) Syntetické analóga PGB2 Dipyridamol Pentoxifylín Antibiotiká .NO donory Kyselina 5-acetylsalicylová Kyselina močová Zhášače HClO Taurín, hypotaurín Zhášače alebo pohlcovače 1O2 Silymarín -karotén Vitamín E Stobadín

113 VI/b Zhášače alebo odstraňovače ROS Odstránenie H2O2 Eliminácia OH.
Kataláza (nepracuje v prítomnosti .NO) N-acetylcysteín Eliminácia OH. Manitol Tiomočovina Stobadín Melatonín Probucol kyselina 5-acetylsalicylová Lazaroidy DMSO, DMTU, BHT kyselina močová Glukóza

114 VI/c Zhášače alebo odstraňovače ROS
Lipidovú oxidáciu prerušujúce antioxidanty (anti LO. a LOO.) Bilirubín Vitamín E Vitamín C -karotenoidy a oxykarotenoidy Stobadín Melatonín Kyselina -lipoová Kyselina močová Lazaroidy BHT, BHA Ehoxykvín 2-metylaminochroman Boli získané určité pozitívne výsledky s pyridoindolom STOBADÍNOM (Katedra chémie a Katedra farmakológie)

115 Ako vieme oxidačný stres kvantifikovať ?
Detekcia voľných radikálov pomerne náročné vzhľadom na fyz. chem. vlastnosti Meranie produktov oxidačného stresu jednoduchšie, široká paleta markérov oxidačného stresu

116 Markéry oxidačného stresu
Posúdenie lipoperoxidácie: malondialdehyd (MDA), konjugované diény, izoprostány Posúdenie poškodenia proteínov: proteínové hydroperoxidy Posúdenie poškodenia DNA: stanovenie modifikovaných nukleozidov

117 Terapeutická vhodnosť ako antioxidantu I
CHOROBA ANTIOXIDANT TERAPEUTICKÝ ÚSPECH Kardiovaskulárne Karotenoidy Kyselina askorbová Tokoferoly Selén Probucol Flavonoidy -  + Novorodenecká hypoxia vyvolávajúca poškodenie Penicillamín Ischémia/reperfúzia srdca, mozgu, čriev, obličiek SOD, SOD+CAT Kyselina lipoová Allopurinol Deferoxamín Transplantácia a prezervácia tkanív

118 II CHOROBA ANTIOXIDANT TERAPEUTICKÝ ÚSPECH Intravaskulárne hemoragie
Tokoferoly Kyselina askorbová + Agregácia trombocytov Flavonoidy Stobadín Hemochromatóza Deferoxamín ++ Traumy hlavy Lazaroidy Deriváty stobadínu Fenyl-butyl-nitóny  Subarachnoidálne krvácania Respiračný distres syndróm (IRDS, ARDS) SOD Allopurinol Bronchiálna asthma SOD+CAT Tioly  - Poškodenie pľúc N-acetylcysteín

119 ROS v slede dejov pri NEUROTRAUMY
TRAUMA Excitačné uvoľnenie aminokyselín (GLU) Ca2+ influx do buniek Aktívácia zápalovej kaskády Aktivácia proteáza/lipáza (PAF, eikozanoidy, Depolarizácia buniek cytokíny, aktivácia PMN) ( Mg bloku NMDA rec.) Tvorba ROS Na+influx devastácia bunky Edém NEURONÁLNA SMRŤ TRIÁDA: EXCITOTOXICITA, Ca-OVERLOAD, OXIDATÍVNY STRES Terapeutické intervencie: -SH donory (N-acetylcysteín), lazaroidy, steroidy, deferoxamín, SOD, vitamíny A,E,C, pyridoindoly, stobadin, PBN, flavonoidy (kvercetin), PAF antagonisti (BN )

120 III CHOROBA ANTIOXIDANT TERAPEUTICKÝ ÚSPECH Influenza (chladová)
Kyselina askorbová  Retrolentálna fibroplazia Tokoferoly + Katarakta Zápalové ochorenia čriev (IBD) 5-aminosalicyláty Sulfasalazin Sulfapyridin SOD+CAT Glukány Hepatopatie Kyselina lipoová Silymarín Stobadin Intoxikácia paracetamolom N-acetylcysteín ++ Chemické otravy Glutation Deferoxamín Fotosenzibilizácia Karotenoidy Tretionín UV ožiarenie

121 IV CHOROBA ANTIOXIDANT TERAPEUTIC. ÚSPECH Reumatoidná artritída SOD
Penicillamín Deferoxamín  + Parkinsomizmus Tokoferoly Wilsonova choroba ++ Cerebro-vaskulárne spazmy Karotenoidy Tioly Nádory SOD+CAT Kyselina askorbová Selén Flavonoidy -  -

122 Závery I ROS účinkujú prostredníctvom:
zvýšenie peroxidácie membránových lipidov zvýšenie tvorby prostaglandínov zvýšenie intracelulárneho voľného vápnika alterácia konduktivity iónových kanálov alterácia aktivity enzýmov alterácia uvoľňovania/účinku neurotransmitérov redukcia polčasu a biologicky aktívnych látok poškodenie proteínov poškodenie DNA, génov a proteosyntézy poškodenie uhľovodíkov Mechanizmy účinku ROS sa líšia v mnohých biologických tkanivách. Ich účinky závisia od podmienok samotného tkaniva, príslušného epitelu, endotelu, inervácie apod.

123 Závery II Účinkom ROS je možné zabrániť alebo ich zastaviť pomocou:
redukcie ich tvorby - eliminácia nežiadúcich fyzických a chemických vplyvov - ochrana tkanív pred chronickým zápalom - ochrana tkanív pred ischémiou ich elimináciou - substitúcia antioxidačných enzýmov - substitúcia neenzýmových antioxidantov a zhášačov interakcia s ich účinkom - protekcia buniek pred intracelulárnym voľným akumulovaným vápnikom a jeho účinkami

124 Obranné mechanizmy závislé na glutatióne

125 Závery III Terapeutické úspechy za použitia antioxidantov, odpratávačov a zhášačov
Tieto sú Klinických štúdií s dobrým výsledkom napr. pri fotosenzibilizácii, intoxikácii paracetamolom, hemochromatóze Kontroverzných klinických štúdií napr. pri ischémii/reperfúziiusion, subarachnoidálnom krvácaní, respiračných distres syndrómoch Minimálny terapeutický účinok napr. in asthma bronchiale, nádory

126 Ďakujem za pozornosť