ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ-ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ

Παρουσίαση με θέμα: "ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ-ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ-ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ
ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΑ Ι.Κ.ΑΓΓΕΛΗ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ-ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ

2 Αντιγόνο (Antigen): ουσία που συνδέεται ειδικά με ένα μόριο αντισώματος ή με τον επιφανειακό υποδοχέα των δραστικών Τ λεμφοκυττάρων και μπορεί να αποτελέσει στόχο της ανοσολογικής απάντησης Β-κύτταρο + αντιγόνο Τ-κύτταρο + αντιγόνο Εκτελεστικό Β-κύτταρο Β-κύτταρο μνήμης Εκτελεστικό Τ-κύτταρο Τ-κύτταρο μνήμης πλασματοκύτταρο CTL, Th, κλπ (εκκρίνουν κυτταροκίνες & κυτταροτοξικούς παράγοντες) (εκκρίνει αντισώματα)

3 Περιοχές των αντιγόνων που συνδέονται με διαλυτά
ΕΠΙΤΟΠΟΙ Διακριτές περιοχές μακρομορίου = επίτοποι ή αντιγονικοί καθοριστές Π.χ. επίτοπος πρωτεϊνικού αντιγόνου μπορεί να εμπλέκει στοιχεία της α’- β’- γ’- ή και δ’-ταγούς δομής του Β-κύτταρα αναγνωρίζουν διαλυτό αντιγόνο ΕΝΩ Τ κυτταρικοί επίτοποι προέρχονται από ενζυμική πέψη πεπτιδίων και αναγνωρίζονται όταν συνδέονται με μόρια MHC Περιοχές των αντιγόνων που συνδέονται με διαλυτά αντισώματα ή υποδοχείς Β ή Τ λεμφοκυττάρων

4 ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ-ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ ΒΑΣΕΙ ΜΗ ΟΜΟΙΟΠΟΛΙΚΩΝ ΔΥΝΑΜΕΩΝ
ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ ΑΠΑΙΤΕΙΤΑΙ ΜΕΓΑΛΟΣ ΑΡΙΘΜΟΣ ΚΑΙ ΥΨΗΛΗ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΟΤΗΤΑ ΩΣΤΕ ΝΑ ΕΧΟΥΜΕ ΙΣΧΥΡΗ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΗ

5 ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ-ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ
Δυναμική των αλληλεπιδράσεων σταθερά σύνδεσης κ σταθερά διάστασης k1 Ag + Ab Ag-Ab k2 k1/k2= σταθερά αλληλεπίδρασης ή συγγένειας Συγγένεια (affinity): ένταση αλληλεπιδράσεων μεταξύ μορίου Ab με έναν επίτοπο του Ag Δυναμικότητα / συνάφεια (avidity): πολλαπλές θέσεις δέσμευσης Ab-Ag =το γινόμενο των τιμών συγγένειας μεμονωμένων θέσεων δέσμευσης Ab-Ag π.χ. IgG (2 δεσμευτικές θέσεις συνάφεια = σταθερά συγγένειας2) <<< λόγω γεωμετρικών φραγμών Η υψηλή συνάφεια μπορεί να αντισταθμίσει τη χαμηλή συγγένεια (αριθμητική παράμετρος) «σύνδεση» προσεγγίζει το επίπεδο σταθερότητας ενός ομοιοπολικού δεσμού λόγω του αριθμού των δεσμών [IgM-πενταμερής μικρή συγγένεια ΑΛΛΑ υψηλή συνάφεια λόγω μεγαλύτερου σθένους]

6 Αλληλεπίδραση αντισώματος-αντιγόνου
(μη ομοιοπολικές αλληλεπιδράσεις) υπερμτβλ περιοχές αντισώματος ή συμπληρωματικές καθοριστικές περιοχές (complementarity-determining regions, CDRs) ΚΑΙ επίτοπος αντιγόνου μτβλ περιοχή ελαφριάς αλυσίδας μτβλ περιοχή βαριάς αλυσίδας 15-22 αμινοξέα του ag συνδέονται με το ab σύνδεση με δεσμούς Η+, ιοντικές και υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις, van der Walls (για ισχυρή αλληλεπίδραση απαιτείται μεγάλος αριθμός) Είδη επιτόπων: πολλαπλοί επίτοποι στο ίδιο αντιγόνο ανοσοεπικρατούντες ή κυρίαρχοι μη αλληλοεπικαλυπτόμενοι αλληλοεπικαλυπτόμενοι γραμμικοί ή συνεχείς διαμορφωτικοί κρυπτικοί

7 ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ μονοκλωνικά, πολυκλωνικά αντισώματα
ανασυνδυασμένα πεπτίδια Ευχρηστία Αυτοματισμός αυξημένη ευαισθησία αυξημένη ειδικότητα αυξημένη αξιοπιστία σε όλα τα επίπεδα Η ανάπτυξη και η αναβάθμιση του υλικο-τεχνικού εξοπλισμού: - Μηχανικές, ηλεκτρονικές, μεγάλης ακρίβειας αναλώσιμου ρύγχους, (πολυκάναλες ή μη) πιπέτες - Ανοικτά ανοσολογικά συστήματα (robotic pippeting, washer, reader) - Αυτόματα ανοσολογικά συστήματα (combining incubation, washing and reading) Πλήρως αυτοματοποιημένα συστήματα Μεγάλος αριθμός δειγμάτων Ασφάλεια και Ακρίβεια Επαναληψιμότητα και αξιοπιστία Εκτυπώσιμα αποτελέσματα Επεξεργασία αποτελεσμάτων Ηλεκτρονική μεταφορά δεδομένων ΑΝΟΣΟΔΟΚΙΜΑΣΙΕΣ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΑΣΘΕΝΕΙΩΝ,ΠΑΡΑΚΟΛΟΥΘΗΣΗ ΕΠΙΠΕΔΩΝ ΑΝΣ ΑΠΟΚΡΙΣΗΣ, ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΜΟΡΙΩΝ ΕΝΔΙΑΦΕΡΟΝΤΟΣ

8 ΤΥΠΟΙ ΑΝΟΣΟΑΝΤΙΔΡΑΣΕΩΝ
ΤΥΠΟΙ ΑΝΟΣΟΑΝΤΙΔΡΑΣΕΩΝ Αντιδράσεις καθίζησης (κατακρήμνισης,precipitation) (ab δισθενές+ag δι-/πολυ-σθενέςπλέγμαίζημα) σε υγρό μέσο σε πήκτωμα αγαρόζης Αντιδράσεις συγκόλλησης (σχηματισμός κροκίδων,agglutination) άμεση έμμεση ή παθητική ανασταλτική Αντιδράσεις με τη χρησιμοποίηση επισημασμένου αντιγόνου ή αντισώματος RIA ELISA-ELISPOT Western blotting,Ανοσοκατακρήμνιση Ανοσοφθορισμός-Κυτταρομετρία ροής Αντιδράσεις του συμπληρώματος Μέθοδοι προσδιορισμού των HLA αντιγόνων

9 ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ ΑΝΟΣΟΑΝΤΙΔΡΑΣΕΩΝ
Δοκιμασία Ευαισθησία (μg Ab/ml) Κατακρήμνιση σε διάλυμα 20-200 Κατακρήμνιση σε πήκτωμα Μancini Ouchterlony 10-50 Ανοσοηλεκτροφόρηση Rocket ηλεκτροφόρηση 2 Αντιδράσεις συγκόλλησης Άμεση Παθητική Ανασταλτική 0.3 RIA ELISA ELISA με χημειοφωταύγεια ~ ~ Ανοσοφθορισμός 1 Κυτταρομετρία ροής

10 ΤΥΠΟΙ ΑΝTIΔΡΑΣΕΩΝ ΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗΣ
σε υγρό μέσο σε πήκτωμα απλή ανοσοδιάχυση (προς μία κατεύθυνση) διπλή ανοσοδιάχυση (προς μία κατεύθυνση) διπλή ανοσοδιάχυση (προς δύο κατευθύνσεις-Ouchterlony) κυκλοτερής ή ακτινωτή ανοσοδιάχυση (Mancini) ανοσοηλεκτροφόρηση-ηλεκτροφόρηση rocket

11 ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΙΖΗΜΑΤΟΣ-ΖΩΝΗ ΙΣΟΔΥΝΑΜΙΑΣ
ΑΝΟΣΟΔΙΑΧΥΣΗ ΣΕ ΠΗΚΤΩΜΑ Mancini Ouchterlony

12 ΑΝΟΣΟΔΙΑΧΥΣΗ ΣΕ ΠΗΚΤΩΜΑ
Mancini Ouchterlony σχμ δακτυλίου σχμ τόξων κατακρήμνισης

13 ΑΝΟΣΟΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ (ηλεκτροφόρηση κ διπλή ανοσοδιάχυση)
Μονοκλωνικές ανοσοσφαιρίνες αποτελούνται από βαριές και/ ή ελαφρές αλυσίδες ( 5 κατηγορίες βαριών: γ στην IgG, α στην IgA, μ στη IgM, δ στη IgD και ε στην IgΕ). Ελαφριές αλυσίδες κ & λ. Ανοσοηλεκτροφόρηση = ποιοτική μέθοδος [συνδυασμός ηλεκτροφόρησης και ανοσοδιάχυσης] = αντιγονικές πρωτεΐνες διαχωρίζονται ~ φορτίο σε γέλη αγαρόζης, ακολουθεί ταυτοποίηση μέσω ανοσοκατακρήμνισης με αντιορούς (ταυτοποίηση μονοκλωνικής πρωτεΐνης και καθορισμός του τύπου των ελαφριών και βαριών αλυσίδων) ΑΝΟΣΟΑΝΕΠΑΡΚΕΙΕΣ-ΑΝΟΣΟΫΠΕΡΠΛΑΣΤΙΚΕΣ ΑΝΩΜΑΛΙΕΣ >>ελαφριές αλυσίδες - νεφρική ανεπάρκεια, εναπόθεση ινιδίων αμυλοειδούς κ καταστροφή στα εγγύς σωληνάρια ή στο σπείραμα  ιζηματική νόσος ελαφριών αλυσίδων. Το 90% των ασθενών με πολλαπλούν μυέλωμα εμφανίζουν >> πρωτεΐνη στον ορό ή στα ούρα κατά τη διάγνωση. Τμήματα βαριών αλυσίδων καθώς και ελεύθερες ελαφριές αλυσίδες παρατηρούνται στα ούρα ασθενών με πολλαπλούν μυέλωμα ή αμυλοείδωση. Οι ανοσοσφαιρίνες IgD και IgΕ δε μπορούν να ανιχνευθούν γιατί βρίσκονται σε χαμηλές συγκεντρώσεις και δε σχηματίζουν ίζημα. ΑΥΣΤΗΡΑ ΠΟΙΟΤΙΚΗ ΤΕΧΝΙΚΗ διαχωρισμός αντιγόνων, αντιορός στην αύλακα, διάχυση κ’ κατακρήμνιση

14 ROCKET ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ κωνοειδής ηλεκτροφόρηση: ποσοτικός προσδιορισμός αντιγόνου (κώνοι κατακρήμνισης) pH  ab ακίνητο + ag φορτίζεται (-) Κωνοειδείς κατακρημνίσεις με ύψος ~ [ag] {ab >>>> ισοηλ. σημείο /// αλκαλικό pH ab-ουδέτερο vs. αg (-) }

15 ΑΝΟΣΟΚΑΘΗΛΩΣΗ Ανοσοκαθήλωση = ποιοτική μέθοδος (50 φορές πιο ευαίσθητη vs ανοσοηλεκτροφόρηση). Διαχωρισμός πρωτεϊνών ~ φορτίο σε γέλη αγαρόζης & ταυτοποίηση ανοσοκαθήλωσης χρησιμοποιώντας ειδικούς μονοδύναμους αντιορούς  επιτυγχάνεται η ταυτοποίηση της μονοκλωνικής πρωτεΐνης και ο καθορισμός του τύπου των ελαφριών και βαριών αλυσίδων. Η μέθοδος αυτή ενδείκνυται ιδιαίτερα σε περιπτώσεις που πρέπει να ανιχνευθούν εξαιρετικά χαμηλές συγκεντρώσεις ανοσοσφαιρινών όπως για παράδειγμα σε μυέλωμα Bence Jones τύπου IgD και IgE, σε αμυλοείδωση, μονήρες πλασμοκύττωμα καθώς και στη διάγνωση υποτροπών μετά από μεταμόσχευση μυελού των οστών. Η ανοσοκαθήλωση είναι ταχύτερη, πιο ευαίσθητη και ευκολότερη στην ερμηνεία από την ανοσοηλεκτροφόρηση. Αντιθέτως, η ανοσοηλεκτροφόρηση είναι ευκολότερη από τεχνικής άποψης και λιγότερο δαπανηρή από την ανοσοκαθήλωση. Η υψηλή αναλυτική ευαισθησία της ανοσοκαθήλωσης έχει ως αποτέλεσμα να ανιχνεύεται υψηλότερο ποσοστό κλινικά ασχέτων ευρημάτων τα οποία μπορεί να οδηγήσουν σε επιπλέον διαγνωστική διερεύνηση. Ανοσοκαθήλωση ορού ασθενούς με μυέλωμα τύπου IgM λ

16 Κλινική Χρησιμότητα Μεταβολές Μακροσφαιριναιμία Waldenstrom
• Επιτρέπει την ανίχνευση ανοσοσφαιρινών που βρίσκονται σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις στον ορό Μεταβολές • Πολλαπλούν μυέλωμα • Μακροσφαιριναιμία του Waldenström • Αμυλοείδωση • Λεμφοϋπερπλαστικές νόσοι

17 ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ ΣΥΓΚΟΛΛΗΣΗΣ (σχμ κροκίδων)
ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ ΣΥΓΚΟΛΛΗΣΗΣ (σχμ κροκίδων) ΑΝΤΙΣΩΜΑ ΜΕ ΜΕΓΑΛΥΤΕΡΗ ΙΣΧΥ ΣΥΝΔΕΣΗΣ ΣΕ ΣΧΕΣΗ ΜΕ ΤΙΣ ΑΠΩΘΗΤΙΚΕΣ ΔΥΝΑΜΕΙΣ ΜΕΤΑΞΥ ΤΩΝ ΣΩΜΑΤΙΔΙΩΝ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ ΚΑΤΑΛΛΗΛΗ ΑΝΑΛΟΓΙΑ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ-ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΗΛΕΚΤΡΟΛΥΤΗ Τύποι αντιδράσεων (ευαίσθητες, απλές, οικονομικές) άμεση συγκόλληση (πχ. τυποποίηση ομάδων αίματος, διάγνωση βακτηριακών λοιμώξεων) έμμεση ή παθητική συγκόλληση (για διαλυτά Αg, ερυθροκύτταρα ευαισθητοποιημένα με Αg ή σωματίδια latex, πχ. μέθοδος Coombs) ανασταλτική συγκόλληση (πχ. test εγκυμοσύνης, ένδειξη/ανίχνευση χρήσης απαγορευμένων ουσιών [κοκαΐνης, ηρωίνης] ??? νόμιμα φάρμακα με παρόμοιες χημικές δομέςδιασταυρωτή αντίδραση, αναγκαία επιβεβαίωση με μη ανσ μέθοδο

18 COOMBS Π.χ. αιμολυτική αναιμία Π.χ. μεταγγίσεις

19 ΑΝΑΣΤΟΛΗ ΣΥΓΚΟΛΛΗΣΗΣ ανίχνευση ερυθροποιητίνης [ολυμπιάδα 2004]

20 ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΕΠΙΣΗΜΑΣΜΕΝΩΝ ΑΝΤΙΓΟΝΩΝ Η΄ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ
Η επισήμανση γίνεται με μόρια που επιτρέπουν την εύκολη ανίχνευση και μέτρησή τους [RIA, ELISA – ELISPOT, ανοσοστύπωμα Western, ανoσοφθορισμός – κυτταρομετρία ροής ] ΜΕΘΟΔΟΣ RIA (radioimmunoassay) Π.χ. ανίχνευση ιού ηπατίτιδας Β ΑΞΙΟΣΗΜΕΙΩΤΗ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ ΥΨΗΛΗ ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΑ ΑΝΤΑΓΩΝΙΣΜΟΣ ΜΕ ΤΟ ΡΑΔΙΕΝΕΡΓΑ ΣΗΜΑΣΜΕΝΟ ΑΝΤΑΓΩΝΙΣΤΗ ΤΟΥ ΓΙΑ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΕΝΟ ΠΟΣΟ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ 1960: Rosalyn Yalow, Solomon Aaron Berson (Bronx Veterans Administration Hospital / Mount Sinai School of Medicine) Rosalyn ! Nobel Prize Ιατρικής (RIA ινσουλίνης σε διαβητικούς) Γνωστή ποσότητα αντιγόνου καθίσταται ραδιενεργή (ιώδιο σε κατάλοιπα τυροσίνης) Ακολουθεί ανάμιξη με αντίσωμα ώστε να καλύπτονται ΟΛΕΣ οι θέσεις δέσμευσης του αντιγόνου σύμπλοκο Προστίθεται δείγμα ορού (κρύο αντιγόνο) σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις  ανταγωνισμόςαντικαθιστά το ραδιενεργό Μέτρηση ελεύθερου αντιγόνου στο υπερκείμενο

21 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)-ασφαλέστερη και οικονομικότερη από RIA , ένζυμο αντί ραδιοσήμανση και χρωμογόνο υπόστρωμα με αντίσωμα υψηλότερη αρχική συγκέντρωση αντιγόνου χαμηλότερη απορρόφηση Χημειοφωταύγεια >>>> ευαισθησία

22 ELISPOT ΑΝΟΣΟΣΤΥΠΩΜΑ WESTERN
Πήκτωμα επιστοίβαξης (ακρυλαμίδη) pH 6.8 συγκέντρωση των πρωτεϊνών σε μια γραμμή εκκίνησης Πήκτωμα διαχωρισμού pH 8.8 διαχωρισμός πρωτεϊνών ανάλογα με το ΜΒ τους και τη δομή τους SDS-PAGE ανίχνευση ενεργοποιημένων κυττάρων και αναγωγή στο σύνολο των κυττάρων που εξετάστηκαν

23 ΑΝΑΛΥΣΗ ΚΑΤΑ WESTERN

24 ΑΝΑΛΥΣΗ ΚΑΤΑ WESTERN Επώαση με το πρώτο αντίσωμα και
Φίλτρο νιτροκυτταρίνης όπου έχουν μεταφερθεί οι πρωτεΐνες Ανίχνευση της πρωτεΐνης Επώαση με το πρώτο αντίσωμα και δέσμευσή του με το αντιγόνο Επώαση με το πρώτο αντίσωμα και δέσμευσή του με το αντιγόνο Επώαση με το δεύτερο αντίσωμα (συζευγμένο) HRP H2O2 + DAB/luminol +

25 ΑΝΟΣΟΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗ Επιτρέπει την απομόνωση του αντιγόνου
Ευαίσθητη δοκιμασία για ανίχνευση παρουσίας αντιγόνου σε κύτταρα ή ιστό Εκχύλισμα κυττάρων αναμιγνύεται με αντίσωμα--προσθήκη συνθετικών σφαιριδίων-- συλλογή με φυγοκέντρηση ή προσθήκη δευτερογενούς αντισώματος συζευγμένου με μαγνητικά σφαιρίδια Κύτταρο με μγν σφρδ προσκολλημένα στην επιφάνειά του μέσω ab

26 ΑΝΟΣΟΦΘΟΡΙΣΜΟΣ Φθορίζοντα μόρια απορροφούν φως (διέγερση) και εκπέμπουν σε διαφορετικά μήκη κύματος Σύζευξη αντισώματος με φθοριοχρώματα, το εκπεμπόμενο φως γίνεται ορατό με μικροσκόπια φθορισμού (πηγή υπεριώδους)… Φλουορεσκεϊνη, ροδαμίνη, φυκοερυθρίνη κ.α. συνδέονται με το Fc τμήμα του αντισώματος

27 ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ (fluorescence-activated cell sorting)
εναιώρημα ζωντανών κυττάρων + φθορισμο-ενεργοποιούμενος διαλογέας κυττάρων  μέτρηση έντασης φθορισμού & διαχωρισμός κυτταρικών πληθυσμών ~ επιφανειακά αντιγόνα (τυποποίηση λευχαιμιών)

28 ΠΡΩΤΕΟΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ 1. ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ~ ΦΟΡΤΙΟ [ΙΣΟΗΛΕΚΤΡΙΚΗ ΕΣΤΙΑΣΗ] ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ~ ΜΟΡΙΑΚΗ ΜΑΖΑ ΠΕΔΙΟ ΥΨΗΛΗΣ ΤΑΣΗΣ  ΜΕΤΑΚΙΝΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕ ΣΤΑΘΕΡΗΣ ΚΛΙΣΗΣ pH ΚΑΙ ΕΝΤΟΠΙΣΜΟΣ ΣΤΟ ΙΣΟΗΛΕΚΤΡΙΚΟ ΤΟΥΣ ΣΗΜΕΙΟ

29 ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΟΣ
Κύριος δραστικός συντελεστής του χυμικού κλάδου του ΑΣ

30

31 ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΟΣ
Προϋποθέσεις: ανιχνεύει Ab στον ορό το σύμπλεγμα Ag-Ab που «καταναλώνει» το συμπλήρωμα δεν είναι ορατό χρειάζεται δείκτης = αιμολυτικό σύστημα Αιμολυτικό σύστημα = ερυθρά αιμοσφαίρια προβάτου (Ag) και ορός ζώου που περιέχει Ab έναντι των ερυθρών αιμοσφαιρίων του προβάτου ΠΡΟΣΟΧΗ: θετική είναι η αντίδραση που δε δίνει αιμόλυση

32 ΑΙΜΟΛΥΤΙΚΟ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑ

33 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ HLA ΑΝΤΙΓΟΝΩΝ
Προϋποθέσεις: Τ λεμφοκύτταρα (τυποποίηση για τα τάξης Ι) και Β λεμφοκύτταρα (τυποποίηση για τα τάξης ΙΙ) πολυκλωνικοί ή μονοκλωνικοί αντι-HLA αντιοροί Μέθοδοι που χρησιμοποιούνται: μικρολεμφοκυτταρική δοκιμασία (ορολογική τυποποίηση) μοριακές μέθοδοι (PCR) μικτή λεμφοκυτταρική αντίδραση (MLR) - [In vitro μέθοδος με την οποία εξετάζουμε τη λειτουργική κατάσταση του ανοσοποιητικού συστήματος ελέγχοντας τη δυνατότητά του να απαντά σε αυτόλογα ή ετερόλογα αντιγόνα]

34 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΑ ΜΟΝΤΕΛΑ ΣΕ ΖΩΑ ΜΟΝΤΕΛΑ πρωτοπαθούς ανοσοανεπάρκειας
γυμνό ή αθυμικό ποντίκι (nu/nu)  άτριχα με υποτυπώδη θύμο - ευαίσθητα (αποστειρωμένο φαγητό, νερό, κλωβό, και χρήση φίλτρων αέρα) και δε ζουν πολύ [ανάπτυξη όγκων] – ανεπάρκεια κυτταρομεσολαβητικής ανοσίας ποντίκια SCID (severe combined immunodeficiency disease) διαθέτουν ανώριμα κύτταρα Τ και Β σειρών  αδυναμία προσαρμοστικών ανοσολογικών αποκρίσεων, μηχανισμοί απόρριψης μη λειτουργικοί μεταμοσχεύσεις κυττάρων, οργάνων ανθρώπινης προέλευσης ………………………………………………………………………………………………………………………………….. ΔΙΑΓΟΝΙΔΙΑΚΑ ΖΩΑ  εισαγωγή επιπλέον γονιδίου vs knock out ζώα  εξάλειψη γονιδίου