ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΚΑΙ ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ ΕΛΕΥΘΕΡΟΥ ΕΜΒΡΥΪΚΟΥ DNA ΣΤΗ ΜΗΤΡΙΚΗ ΚΥΚΛΟΦΟΡΙΑ Ν. Δάβανος και Δ. Χ. Σπάθας Εργαστήριο Γενικής Βιολογίας, Τμήμα Ιατρικής,

Παρουσίαση με θέμα: "ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΚΑΙ ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ ΕΛΕΥΘΕΡΟΥ ΕΜΒΡΥΪΚΟΥ DNA ΣΤΗ ΜΗΤΡΙΚΗ ΚΥΚΛΟΦΟΡΙΑ Ν. Δάβανος και Δ. Χ. Σπάθας Εργαστήριο Γενικής Βιολογίας, Τμήμα Ιατρικής,"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΚΑΙ ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ ΕΛΕΥΘΕΡΟΥ ΕΜΒΡΥΪΚΟΥ DNA ΣΤΗ ΜΗΤΡΙΚΗ ΚΥΚΛΟΦΟΡΙΑ Ν. Δάβανος και Δ. Χ. Σπάθας Εργαστήριο Γενικής Βιολογίας, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Το μητρικό πλάσμα περιέχει ελεύθερο μητρικό και εμβρυϊκό DNA Ανάλυση εμβρυϊκού DNA στο μητρικό πλάσμα: Ανίχνευση Υ ειδικών αλληλουχιών με συμβατική ή Real Time PCR – εφαρμογή μόνο σε κυήσεις με άρρενα έμβρυα Ανίχνευση εμβρυϊκών αλληλομόρφων αυτοσωμικών STRs πατρικής προέλευσης με QF-PCR – εφαρμογή σε όλες τις κυήσεις Για έναν STR στο μητρικό πλάσμα υπάρχουν 2 μητρικά και 2 εμβρυϊκά αλληλόμορφα Εμβρυϊκά αλληλόμορφα: 1 μητρικής και 1 πατρικής προέλευσης Το μητρικής προέλευσης εμβρυϊκό αλληλόμορφο δεν ανιχνεύεται Η ανίχνευση του πατρικής προέλευσης εμβρυϊκού αλληλομόρφου προϋποθέτει να διαφέρει από τα μητρικά αλληλόμορφα Για να συμβαίνει αυτό το έμβρυο πρέπει να είναι ετεροζυγωτικό Ετεροζυγωτική μητέρα / Ομοζυγωτικός ή ετεροζυγωτικός πατέρας με διαφορετικά αλληλόμορφα από τη μητέρα (Α) – 3 κορυφές Ομοζυγωτική μητέρα / Ομοζυγωτικός ή ετεροζυγωτικός πατέρας με διαφορετικά αλληλόμορφα από τη μητέρα (Β) – 2 κορυφές Η γνώση μητρικού και πατρικού γονότυπου οδηγεί στην πληροφοριακή ανάλυση του εμβρυϊκού DNA

2 ΥΛΙΚΑ - ΜΕΘΟΔΟΙ 50 δείγματα πλάσματος εγκύων γυναικών σε διαφορετικά στάδια κύησης (8 – 34 εβδομάδες) Χρήση 6 πολυμορφικών STRs: D13S631, D18S535, D21S11, D21S1411, D21S1414 και X22 QF-PCR: Ανάλυση μητρικού και πατρικού DNA – επιλογή πληροφοριακών STRs Ανάλυση DNA από μητρικό πλάσμα με πληροφοριακούς STRs Ανίχνευση εμβρυϊκού αλληλομόρφου πατρικής προέλευσης Προσδιορισμός αναλογίας αλληλομόρφων στο μητρικό πλάσμα: η ένταση φθορισμού του εμβρυϊκού αλληλομόρφου πατρικής προέλευσης προς το άθροισμα των εντάσεων των υπόλοιπων αλληλομόρφων Δημιουργία πρότυπης καμπύλης για τον προσδιορισμό του ποσοστού του ελεύθερου εμβρυϊκού DNA στη μητρική κυκλοφορία: Επιλογή 2 φυσιολογικών δειγμάτων DNA για τη δημιουργία πληροφοριακού μοντέλου προσομοίωσης μητρικού πλάσματος από φυσιολογική κύηση 1ο δείγμα: ετεροζυγωτικό ή ομοζυγωτικό (προσομοίωση φυσιολογικής μητέρας) 2ο δείγμα: ετεροζυγωτικό – 1 κοινό / 1 διαφορετικό αλληλόμορφο με το 1ο δείγμα (προσομοίωση φυσιολογικού εμβρύου) Ανάμιξη DNA από το 2ο δείγμα σε DNA από το 1ο δείγμα Χιμαιρικά δείγματα: 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 25%, 35% και 50%

3 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Ανάλυση χιμαιρικών δειγμάτων με QF-PCR για όλους τους STRs 1ο δείγμα ετεροζυγωτικό: χιμαιρικό δείγμα 3 κορυφές 1ο δείγμα ομοζυγωτικό: χιμαιρικό δείγμα 2 κορυφές Προσδιορισμός της αναλογίας των αλληλομόρφων για κάθε STR στα χιμαιρικά δείγματα Αντιστοίχιση με το ποσοστό του DNA του 2ου δείγματος στο χιμαιρικό δείγμα Δημιουργία πρότυπης καμπύλης για κάθε STR Ανάλυση μητρικού και πατρικού DNA με QF-PCR 50/50 δείγματα πληροφοριακά για τουλάχιστον 1 STR – σημασία υψηλού βαθμού ετεροζυγωτίας των STRs Ανάλυση DNA από το μητρικό πλάσμα με QF-PCR για τους πληροφοριακούς STRs Ανίχνευση εμβρυϊκού αλληλομόρφου πατρικής προέλευσης: Σε 46 / 50 δείγματα Από την 8η εβδομάδα κύησης

4 Ποσοστό εμβρυϊκού DNA (%)
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Ευαισθησία ανίχνευσης εμβρυϊκού αλληλομόρφου πατρικής προέλευσης Ποσοστό εμβρυϊκού DNA στο μητρικό πλάσμα = 1 – 2% Για κάθε STR: Γραμμικές παράμετροι πολύ κοντά στη μονάδα Καλή αντιστοιχία αναλογίας αλληλομόρφων και ποσοστού ελεύθερου εμβρυϊκού DNA στα χιμαιρικά δείγματα Χρήση των καμπυλών για τον προσδιορισμό του ποσοστού του ελεύθερου εμβρυϊκού DNA στα δείγματα μητρικού πλάσματος Δείκτης Πληροφοριακά δείγματα Ποσοστό εμβρυϊκού DNA (%) Μέση Τιμή Διακύμανση D21S11 42 / 50 6 0-16 D21S1411 39 / 50 D21S1414 45 / 50 8 0-20 D18S535 40 / 50 7 0-18 D13S631 37 / 50 X22 35 / 50 Δείκτης R2 m D21S11 0.9433 1.0821 D21S1411 0.9404 1.0466 D21S1414 0.9805 1.0371 D18S535 0.9819 1.0265 D13S631 0.9907 1.0211 X22 0.9935 1.0102

5 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Η ανάλυση με QF-PCR για πολυμορφικούς δείκτες STR στα αυτοσωμικά χρωμοσώματα οδηγεί στην ανίχνευση εμβρυϊκών αλληλομόρφων πατρικής προέλευσης σε δείγματα DNA που απομονώνονται από το πλάσμα εγκύων γυναικών και φέρουν άρρενα ή θήλεα έμβρυα Η ταυτόχρονη χρήση πολλών πολυμορφικών STRs σε διαφορετικά χρωμοσώματα καθιστά την παρουσία πληροφοριακών δειγμάτων δεδομένη σε κάθε κύηση, γεγονός που οφείλεται στον υψηλό δείκτη ετεροζυγωτίας που παρουσιάζουν οι STRs Η ανίχνευση εμβρυϊκών αλληλομόρφων STR πατρικής προέλευσης είναι δυνατή σε ποσοστό ελεύθερου εμβρυϊκού DNA 1-2% στο μητρικό πλάσμα Τα αποτελέσματα της ανάλυσης πληροφοριακών δειγμάτων μητρικού πλάσματος δείχνουν ότι το ποσοστό του ελεύθερου εμβρυϊκού DNA σε φυσιολογικές κυήσεις είναι περίπου 7% του συνολικού DNA και μπορεί να φτάσει μέχρι το 20% Ενδιαφέρει η μελέτη διακύμανσης του ποσοστού του ελεύθερου εμβρυϊκού DNA στο πλάσμα εγκύων γυναικών που φέρουν ανευπλοειδικά έμβρυα