Ανίχνευση υψηλών επιπέδων ενδοκυττάριων ενεργών μορφών οξυγόνου (ROS) και ανεπάρκειας αντιοξειδωτικών μηχανισμών σε προγονικά κύτταρα ασθενών με Μυελοδυσπλαστικά.

Παρουσίαση με θέμα: "Ανίχνευση υψηλών επιπέδων ενδοκυττάριων ενεργών μορφών οξυγόνου (ROS) και ανεπάρκειας αντιοξειδωτικών μηχανισμών σε προγονικά κύτταρα ασθενών με Μυελοδυσπλαστικά."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Ανίχνευση υψηλών επιπέδων ενδοκυττάριων ενεργών μορφών οξυγόνου (ROS) και ανεπάρκειας αντιοξειδωτικών μηχανισμών σε προγονικά κύτταρα ασθενών με Μυελοδυσπλαστικά Σύνδρομα (ΜΔΣ) Βουκελάτου Γ, Θανοπούλου Ε, Ντάλλας Κ, Φερτάκης Β, Δημοπούλου Α, Λαμπροπούλου Π, Κουράκλη-Συμεωνίδη Α, Συμεωνίδης Α, Ζούμπος Ν. Τομέας Αιματολογίας, Ιατρική σχολή, Πανεπιστήμιο Πατρών Μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα (MDS) Ετερογενής ομάδα αιματολογικών νοσημάτων που αφορά τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα Μη αποδοτική αιμοποίηση και ανθεκτική κυτταροπενία του περιφερικού αίματος Μυελός των οστών: υπερκυτταρικός ή φυσιολογικός ως προς την κυτταροβρίθεια Μεγάλη πιθανότητα μετάπτωσης του νοσήματος σε οξεία μυελογενή λευχαιμία (AML) Οξειδωτικό stress (ΟS) Οξειδωτική βλάβη από δραστικές μορφές οξυγόνου (ROS, Reactive Oxygen Species), πχ Η2Ο2 και Ο2ˉ Εμπλοκή ΟS στην παθογένεια των MDS;

2 ΑΣΘΕΝΕΙΣ-ΜΕΘΟΔΟΙ 25 ασθενείς MDS → low risk (5q-, RA, RARS, RCMD)
→ high risk (RAΕΒ-Ι, RAΕΒ-ΙΙ ) 19 controls: cord blood (CB), normal bone marrow (ΝΒΜ), mobilized peripheral blood (mPB) Απομόνωση μονοπύρηνων κυττάρων μυελού των οστών (BM MNCs) Μαγνητικός διαχωρισμός προγονικών αιμοποιητικών CD34+ κυττάρων-MACS (Magnetic Cell Sorting) 1) ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΕΝΔΟΚΥΤΤΑΡΙΩΝ ROS ΜΕ Η2DCF-DA (2′,7′-dichlorodihydrofluoresceine diacetate) Κυτταρομετρία ροής (FACS, Fluorescence Activated Cell Sorting Analysis) 2) ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΑ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ OxyBlot Protein Oxidation Detection Kit (protein carbonyl + DNPH → DNP) - SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση - Western Blotting (anti-DNP antibody) 3) ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΩΝ ΕΝΖΥΜΩΝ, ΚΑΤΑΛΑΣΗΣ ΚΑΙ MnSOD SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση - Western Blotting

3 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 1) Ενδοκυττάρια ROS (mean ± SEM): CD34-PE NBM
ROS (MFI*) 20 40 60 80 NBM CD34+ MNCs *MFI: mean fluorescence intensity Low Risk MDS High Risk MDS CD34-PE NBM Low Risk Patient High Risk Patient DCF

4 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 2) Οξειδωτικά τροποποιημένες πρωτεΐνες (mean ± SEM) :
1000 2000 3000 4000 CD34+ cells Normal Low Risk MDS High Risk +ve ct: positive control anti-DNP - CD34⁺ cells High Risk Low Risk +ve ct Normal Intensity / μgr total protein 3) Αντιοξειδωτικά ένζυμα: antioxidant/tubulin (mean ± SEM): NORMAL MDS LOW-RISK MDS HIGH-RISK CD34+ Cells CD34- Cells CATALASE 1,7±0,4 1,4±0,4 1,4±0,5 5,0±1,8 1,1±0,3 3,3±1,6 MnSOD 1,1±0,2 1,3±0,4 1,2±0,4 1,4±0,3 0,8±0,2 1,7±0,7

5 ΣΥΖΗΤΗΣΗ-ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ
CD34+ κύτταρα ασθενών MDS: αυξημένα επίπεδα ενδοκυττάριων ROS μεγαλύτερο ποσοστό οξειδωτικά τροποποιημένων πρωτεϊνών ανεπαρκές ενζυμικό αντιοξειδωτικό αμυντικό σύστημα Οξειδωτικό φορτίο: MDS high > MDS low → συμμετοχή στην πορεία και εξέλιξη της νόσου Οξειδωτικό stress: βασικός παθογενετικός παράγοντας των ΜΔΣ ή συνέπεια άλλων παθογενετικών μηχανισμών;