ΑΝΟΣΟΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗ & ΑΝΟΣΟΣΤΥΠΩΜΑ ΚΑΤΑ WESTERN. Προετοιμασία του Πρωτεϊνικού Δείγματος Για να αναλυθούν οι πρωτεΐνες με ανοσοστύπωμα κατά Western ή ανοσοκατακρήμνιση.

Παρουσίαση με θέμα: "ΑΝΟΣΟΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗ & ΑΝΟΣΟΣΤΥΠΩΜΑ ΚΑΤΑ WESTERN. Προετοιμασία του Πρωτεϊνικού Δείγματος Για να αναλυθούν οι πρωτεΐνες με ανοσοστύπωμα κατά Western ή ανοσοκατακρήμνιση."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 ΑΝΟΣΟΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗ & ΑΝΟΣΟΣΤΥΠΩΜΑ ΚΑΤΑ WESTERN

2 Προετοιμασία του Πρωτεϊνικού Δείγματος Για να αναλυθούν οι πρωτεΐνες με ανοσοστύπωμα κατά Western ή ανοσοκατακρήμνιση θα πρέπει να εκχυλιστούν από κύτταρα ή ιστό αλλά και να διατηρηθούν σε διάλυμα. Αυτό επιτυγχάνεται χρησιμοποιώντας απορρυπαντικά όπως Triton X-100, NP-40, SDS κ.λ.π. Συνήθως ως 1% διάλυμα στο κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα που συνήθως περιλαμβάνει 150 mM NaCl, 25 mM Tris-HCI, 2 mM EDTA και αναστολείς πρωτεασών ή φωσφατασών αν μελετάται η φωσφορυλίωση. Ιδιαίτερα στην περίπτωση της ανοσοκατακρήμνισης η επιλογή του απορρυπαντικού είναι πολύ σημαντική αφού οι συνθήκες πρέπει να είναι τέτοιες που να επιτρέπουν την δέσμευση του αντισώματος στο αντιγόνο και όταν μελετούνται πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις το απορρυπαντικό θα πρέπει να τις διατηρεί.

3 1.Εκχύλιση των πρωτεϊνών κυττάρων ή Ιστού στο κατάλληλο απορρυπαντικό 2.Εκχυλίσματα πρωτεϊνών επωάζονται στους 4 ο Cμε αντίσωμα ενάντια σε συγκεκριμένη πρωτεΐνη για 2-16 ώρες. ΑΝΟΣΟΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗ ΜΙΑΣ ΠΡΩΤΕΙΝΗΣ 3.Προστίθενται σφαιρίδια αγαρόζης καλυμμένα με πρωτεΐνη Α ή G που δεσμεύει το αντίσωμα με μεγάλη συγγένεια.

4 ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΤΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΓΙΑ ΑΝΑΛΥΣΗ ΣΕ ΠΗΚΤΩΜΑ ΠΟΛΥΑΚΡΥΛΑΜΙΔΗΣ 3.Τα σύμπλοκα αντιγόνου-αντισώματος σφαιριδίων κατακρημνίζονται με φυγοκέντρηση και διαλυτοποιούνται σε διάλυμα που περιέχει (σε τελικές συγκεντρώσεις) Α. 3% SDS, αποδιατάσσει τις πρωτεΐνες και τους προσδίδει αρνητικό φορτίο. Β.10 mM EDTA για να ανασταλούν οι πρωτεάσες Γ.10 mM EGTA για να ανασταλούν οι πρωτεάσες Δ.50% Γλυκερόλη που βοηθά στο φόρτωμα του πρωτεϊνικού δείγματος στο πηγάδι του πηκτώματος της πολυακρυλαμίδης Ε.Β-μερκαπτοαιθανόλη ή διθειοθρεϊτόλη για να σπάσουν οι δισουλφικοί δεσμοί και να αποδιαταχθούν περαιτέρω οι πρωτεΐνες Ε.Χρωστική της βρωμοφαινόλης μπλε, βοηθά στο φόρτωμα του πρωτεϊνικού δείγματος στο πηγάδι του πηκτώματος της πολυακρυλαμίδης

5 ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΟΥ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ 4. Ανίχνευση του αντιγόνου με αυτοραδιογραφία ή ανοσοτύπωση κατά Western. Αντίσωμα Αντιγόνο 4.Στην συνέχεια κατάλληλος όγκος δειγμάτων φορτώνεται στα πηγάδια του πηκτώματος της πολυακρυλαμίδης.

6 1.Εκχύλιση των πρωτεϊνών κυττάρων ή Ιστού στο κατάλληλο απορρυπαντικό 2.Εκχυλίσματα πρωτεϊνών επωάζονται στους 4 ο Cμε αντίσωμα ενάντια σε συγκεκριμένη πρωτεΐνη για 2-16 ώρες. ΣΥΝ-ΑΝΟΣΟΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗ ΔΥΟ Η ΠΕΡΙΣΣΟΤΕΡΩΝ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ 3.Προστίθενται σφαιρίδια αγαρόζης καλυμμένα με πρωτεΐνη Α ή G που δεσμεύει το αντίσωμα με μεγάλη συγγένεια.

7 4. Ανίχνευση του αντιγόνου με αυτοραδιογραφία ή ανοσοτύπωση κατά Western. 4.Στην συνέχεια κατάλληλος όγκος δειγμάτων φορτώνεται στα πηγάδια του πηκτώματος της πολυακρυλαμίδης. Αντίσωμα Αντιγόνο ΣΥΝ-ΑΝΟΣΟΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗ ΔΥΟ Η ΠΕΡΙΣΣΟΤΕΡΩΝ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ

8 ΑΝΟΣΟΤΥΠΩΜΑ ΚΑΤΑ WESTERN Πήκτωμα επιστοίβαξης: 3-5% Ακρυλαμίδη, pH 6.7. Επιτρέπει την συγκέντρωση όλων των πρωτεϊνών σε μια γραμμή/ζώνη εκκίνησης στο πάνω μέρος του πηκτώματος διαχωρισμού. Πήκτωμα διαχωρισμού: >6% Ακρυλαμίδη, pH 8.9. Επιτρέπει τον διαχωρισμό των πρωτεϊνών ανάλογα με το ΜΒ τους και το σχήμα τους.

9 ΑΝΟΣΟΤΥΠΩΜΑ ΚΑΤΑ WESTERN 3. Με την εφαρμογή τάσης οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται με βάση το ΜΒ τους και το σχήμα τους. Η ηλεκτροφορητική τους κινητικότητα είναι αντιστρόφως ανάλογη του ΜΒ τους. Χρώση με Coomassie brilliant blue Πρωτεϊνικοί δείκτες Δείγματα

10 ΑΝΟΣΟΤΥΠΩΜΑ ΚΑΤΑ WESTERN ΗΜΙ-ΣΤΕΓΝΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΑΠΟ ΤΟ ΠΗΚΤΩΜΑ ΑΚΡΥΛΑΜΙΔΗΣ ΣΤΟ ΦΙΛΤΡΟ ΝΙΤΡΟΚΥΤΤΑΡΙΝΗΣ - κάθοδος Φύλλα Whatman + άνοδος Νιτροκυτταρίνη Πήκτωμα ακρυλαμίδης Κατεύθυνση μεταφοράς

11 ΠΗΚΤΩΜΑ ΠΟΛΥΑΚΡΥΛΑΜΙΔΗΣ ΧΡΩΣΜΕΝΟ ΜΕ COOMASIE BRILIANT BLUE ΠΡΙΝ ΚΑΙ ΜΕΤΑ ΤΗΝ ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΣΕ ΦΙΛΤΡΟ ΝΙΤΡΟΚΥΤΤΑΡΙΝΗΣ

12 ΑΝΟΣΟΤΥΠΩΜΑ ΚΑΤΑ WESTERN H Χρώση με Ponceau S Επαληθεύει ότι οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν από τη ακρυλαμίδη στο φίλτρο νιτροκυτταρίνης Μεταφορά των πρωτεϊνών από Το πήκτωμα ακρυλαμίδης σε Φίλτρο νιτροκυτταρίνης

13 ΑΝΟΣΟΤΥΠΩΜΑ ΚΑΤΑ WESTERN Επώαση με το πρώτο αντίσωμα και δέσμευση του με το αντιγόνο Επώαση με το Δεύτερο αντίσωμα HRP H 2 O 2 + DAB + Ανίχνευση της πρωτεΐνης Φίλτρο νιτροκυτταρίνης όπου έχουν μεταφερθεί οι πρωτεΐνες

14 a b Rf’=a/b b ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΜΑΖΑΣ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ Rf: Είναι ο λόγος της απόστασης που έχει διατρέξει μια πρωτεΐνη μέσα στο πήκτωμα της πολυακρυλαμίδης προς την απόσταση που έχει διατρέξει η χρωστική της βρωμοφαινόλης μπλε.

15 Rf logMΜ ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΜΑΖΑΣ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ Για κάθε πρωτεΐνη του πρωτεϊνικού δείκτη υπολογίζουμε την τιμή Rf και τον λογάριθμο της μοριακής του μάζας. Στην συνέχεια κατασκευάζουμε την αντίστοιχη πρότυπη καμπύλη και αντιστοιχούμε σε αυτή την τιμή Rf της πρωτεΐνης της οποίας θέλουμε να υπολογίσουμε την Μοριακή Μάζα

16 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ 1.Η μεμβράνη πλένεται (3Χ, 5 λεπτά το κάθε πλύσιμο) με 20 ml TBS-T 2.Η μεμβράνη επωάζεται για 45 λεπτά με αντίσωμα ενάντια στην προς μελέτη πρωτεΐνη σε θερμοκρασία δωματίου. 3.Η μεμβράνη πλένεται (3Χ, 5 λεπτά το κάθε πλύσιμο) με 20 ml TBS-T 4.Η μεμβράνη επωάζεται για 45 λεπτά με το δεύτερο αντίσωμα που Φέρει δεσμευμένο το ένζυμο περοξειδάση σε θερμοκρασία δωματίου 5.Η μεμβράνη πλένεται (3Χ, 5 λεπτά το κάθε πλύσιμο) με 20 ml TBS-T 6.Στη μεμβράνη προστίθεται 10 ml υποστρώματος της περοξειδάσης και η αντίδραση επιτρέπεται να συνεχιστεί για ένα λεπτό 7.Το φως που εκπέμπεται καταγράφεται είτε με ειδική κάμερα είτε με X-Ray film.

17 ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ 1.Υπολογίστε την μοριακή μάζα της πρωτεΐνης που ανιχνεύσατε με την τεχνική του ανοσοστυπώματος κατά Western 2.Παρουσιάστε τα πλεονεκτήματα και τα μειονεκτήματα της μεθόδου του ανοσοστυπώματος κατά Western σε σχέση με άλλες ανοσολογικές τεχνικές που έχετε ήδη χρησιμοποιήσει 3.Να αναφέρεται παραδείγματα περιπτώσεων όπου μπορεί να εφαρμοστούν οι τεχνικές του ανοσοστυπώματος κατά Westernκαι της ανοσοκατακρήμνισης