1 ΕΘΝΙΚΟ & ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΠΜΣ : ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ Υπεύθυνος : Καθηγητής Λ.Χ.Μαργαρίτης ΣΕΜΙΝΑΡΙΟ Στρατηγικές στοχευμένης.

Παρουσίαση με θέμα: "1 ΕΘΝΙΚΟ & ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΠΜΣ : ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ Υπεύθυνος : Καθηγητής Λ.Χ.Μαργαρίτης ΣΕΜΙΝΑΡΙΟ Στρατηγικές στοχευμένης."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 1 ΕΘΝΙΚΟ & ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΠΜΣ : ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ Υπεύθυνος : Καθηγητής Λ.Χ.Μαργαρίτης ΣΕΜΙΝΑΡΙΟ Στρατηγικές στοχευμένης γονιδιακής αντικατάστασης και αδρανοποίησης (gene targeting, gene replacement, gene knockout), σε πρότυπα βιολογικά συστήματα ποντικών» « Στρατηγικές στοχευμένης γονιδιακής αντικατάστασης και αδρανοποίησης (gene targeting, gene replacement, gene knockout), σε πρότυπα βιολογικά συστήματα ποντικών» Επιμέλεια Επιμέλεια Μπεϊνά Σοφία, ΑΜ: 314105 Επιμέλεια Επιμέλεια Μπεϊνά Σοφία, ΑΜ: 314105 Μάθημα : Μοριακή Βιολογία Υπεύθυνος Καθηγητής : Γ.Ροδάκης Αθήνα, 2009 1

2 2 Τί ορίζεται ως τεχνική gene targeting (gene replacement, gene knockout); Εισαγωγικά … Η επιλεκτική αδρανοποίηση «γονιδίου-στόχου» σε έναν οργανισμό Στηρίζεται στην αρχή του ομόλογου ανασυνδυασμού μεταξύ 2 τμημάτων DNA 2 Μπεϊνά Σοφία, 2009 Γιατί χρησιμοποιείται; Τι εξυπηρετεί; Πολύτιμα στοιχεία στη διερεύνηση της λειτουργίας γονιδίων και των πρωτεϊνών που κωδικοποιούν Εμπλοκή γονιδίων σε ασθένειες Δοκιμές – έλεγχοι φαρμάκων σε knockout πειραματόζωα

3 3 Μπεϊνά Σοφία, 2009 3 Εισαγωγικά … Η ανακάλυψη της τεχνικής gene targeting Mario R. Capecchi, Martin J. Evans, Oliver Smithies Nobel Prize in Physiology or Medicine, 2007 Αρχές εφαρμογής της γονιδιακής στόχευσης, χειριζόμενοι εμβρυονικά βλαστοκύτταρα (embryonic stem cells- ES cells) 1987 Capecchi and Smithies Στοχευμένη γονιδιακή αδρανοποίηση του γονιδίου της υποξανθίνης -γουανίνης φωσφοριβόσυλο τρανσφεράση (Hprt) ( Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells, Kirk R. Thomas and Mario R. Capecchi, Cell, 1987 )

4 4 Μπεϊνά Σοφία, 2009 4 Οι μέθοδοι του gene targeting  Το gene targeting μπορεί να είναι Classical/Constitutive knockout Conditional knockout Το «γονίδιο-στόχος» αδρανοποιείται πλήρως σε κάθε κύτταρο του σώματος του πειραματόζωου Το «γονίδιο στόχος» αδρανοποιείται επιλεκτικά σε συγκεκριμένο μόνο ιστό του σώματος του πειραματόζωου (tissue-specific), ή σε συγκεκριμένη μόνο χρονική φάση της οντογένεσης του οργανισμού (time specific)

5 5 Μπεϊνά Σοφία, 2009 5 Classical/Constitutive knockout σε ποντίκια  Παράγονται ποντίκια με αδρανοποιημένο το «γονίδιο-στόχο» σε κάθε κύτταρο του σώματος  Βασική αρχή Ομόλογος ανασυνδυασμός (Homologous Recombination) μεταξύ του «γονιδίου στόχου» και ενός τεχνητού ομόλογου τμήματος DNA (artificial DNA - vector) στον πυρήνα εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων

6 6 Μπεϊνά Σοφία, 2009 6 Classical/Constitutive knockout σε ποντίκια Βήματα τεχνικής 1. Κατασκευή τεχνητού τμήματος DNA (artificial construct – gene targeting vector) Χαρακτηριστικά του vector 2 αλληλουχίες DNA (΄5 - ΄3 arms) ομόλογες ως προς τμήμα του «γονιδίου στόχου» ισογενής (isogenic), 1kb,5kb ή περισσότερο neo (neomycin resistance gene) ως θετική επιλογή - HSV-tk ως αρνητική επιλογή 1 μοναδική θέση ενζύμου περιορισμού

7 7 Μπεϊνά Σοφία, 2009 7 Classical/Constitutive knockout σε ποντίκια 2. Απομόνωση ES κυττάρων από πρώιμα έμβρυα ποντικών και καλλιέργειά τους 3. Επιμόλυνση ES κυττάρων με το τμήμα του vector μέσω electroporation ή nuclear microinjection

8 8 Classical/Constitutive knockout σε ποντίκια 4. Επιλογή των μετασχηματισμένων ES κυττάρων (+) neo (-) HSV-tk 5. Microinjection των μετασχηματισμένων ES κυττάρων σε βλαστοκύστεις ποντικών Μπεϊνά Σοφία, 2009 8

9 9 Classical/Constitutive knockout σε ποντίκια Μπεϊνά Σοφία, 2009 9 6. Μεταφορά των βλαστοκύστεων σε θηλυκά – Γέννηση χιμαιρικών ποντικών Διασταυρώσεις χιμαιρικών ποντικών με φυσιολογικά για την παραγωγή τελικά knockout ποντικών ως προς το «γονίδιο-στόχο»

10 10 Μπεϊνά Σοφία, 2009 10 Conditional knockout σε ποντίκια Ποια μειονεκτήματα του constitutive gene targeting μας οδήγησαν στην ανάπτυξη αυτής της νέας τεχνικής ;  15% του constitutive gene targeting καταλήγει σε θάνατο  Πολλά γονίδια εκφράζουν τη δράση τους σε διαφορετικά οντογενετικά στάδια ή σε διαφορετικούς ιστούς Conditional gene targeting Αδρανοποίηση γονιδίου- στόχου σε εξειδικευμένο ιστό ή σε συγκεκριμένη οντογενετική φάση

11 11 Μπεϊνά Σοφία, 2009 11 Conditional knockout σε ποντίκια Η βάση της τεχνικής πρωταρχικός στόχος : παραγωγή ποντικών στα οποία το «γονίδιο-στόχος» μαρκάρεται από αλληλουχίες αναγνώρισης(loxP/Flip) ενζύμων ανασυνδυασμού(Cre/FRT) Cre-loxP recombination system

12 12 Μπεϊνά Σοφία, 2009 1212 Conditional knockout σε ποντίκια Παραγωγή των lox-P flanked ποντικών

13 13 Conditional knockout σε ποντίκια ΔιασταυρώσειςΔιασταυρώσεις lox-P flanked ποντικών με ποντίκια στα οποία η Cre-ρεκομπινάση εκφράζεται υπό τη δράση ιστοειδικού υποκινητή Μπεϊνά Σοφία, 2009 13

14 14 Conditional knockout σε ποντίκια Μπεϊνά Σοφία, 2009

15 15 Μπεϊνά Σοφία, 2009 14 Conditional knockout σε ποντίκια Γονίδια αναφοράς (Reporter genes) Χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση δράσης της Cre-ρεκομπινάσης green fluorescent protein (GFP), luciferase-luciferin, β-galactosidase (lacZ gene) - X-gal, κ.α. Δεν εκφράζονται φυσιολογικά στον ιστό ή στον οργανισμό Παράγοντες που συμβάλουν στην ενίσχυση της τεχνικής αδρανοποίηση μεγάλου τμήματος του «γονιδίου-στόχου» όσο περισσότερο ομόλογο DNA, τόσο καλύτερο αποτέλεσμα ανασυνδυασμού χρήση DNA vector ίδιας σειράς με τα ES κύτταρα (isogenic)

16 16 Μπεϊνά Σοφία, 2009 1515 Φάσμα δυνατοτήτων του gene targeting Διερεύνηση λειτουργίας γονιδίων – πρωτεϊνών(φυσιολογικό, κυτταρικό, μοριακό επίπεδο) Μέλέτη διαδικασίας οντογένεσης – γονίδια στην εμβρυϊκή ανάπτυξη Προσομοίωση μοντέλων σοβαρών ασθενειών (νευροεκφυλιστικές, αυτοάνοσες, διαβήτης, κ.α) – μελέτη του ρόλου διαφόρων παραγόντων/γονιδίων – Θεραπευτικά πρωτόκολλα Εμπλοκή γονιδίων στην ανάπτυξη και επέκταση κακοήθων νεοπλασιών – κατανόηση ογκογενετικών μηχανισμών – απόκριση σε θεραπευτικά πρωτόκολλα Έλεγχος φαρμακευτικών ουσιών σε knockout ποντίκια Πρόκληση μεταλλαγών σε γονίδια στα πλαίσια μελέτης ασθενειών (όγκοι, μεσογειακή - δρεπανοκυτταρική αναιμία, κ.α.)

17 17 Μειονεκτήματα του gene targeting Εξαιρετικά δαπανηρές απαιτήσεις (Πειραματόζωα, εξοπλισμός, κ.λπ.) Μεγάλη αναμονή χρόνου για την ανάπτυξη επιθυμητών γενιών knockout πειραματόζωων Τήρηση απαιτητικών και αυστηρών συνθηκών διαβίωσης πειραματόζωων (στείρες συνθήκες) – έγκριση άδειας από παγκόσμιους οργανισμούς Εξειδικευμένο και καταρτισμένο ερευνητικό προσωπικό στη παραγωγή και διαχείριση knockout ποντικών 15% των knockout ποντικών καταλήγουν σε θάνατο Όχι άμεση συσχέτιση αποτελεσμάτων με τον άνθρωπο Μπεϊνά Σοφία, 2009 16

18 18 Βιβλιογραφία Μπεϊνά Σοφία, 2009 17 Lakso M., B., Sauer, B. Mosinger, et.al., “Targeted oncogene activation by site- specific recombination in transgenic mice”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA.89:6232– 6236, 1992 LePage D.F., Conlon R.A., “Animal models for disease: knockout, knock-in, and conditional mutant mice”, Methods Mol Med, 129:41-67, 2006 Manuel A. Vega, “Gene targeting”, CRC Press, 1994 Mario R. Capecchi, “Essay: Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century”, Nature Reviews Genetics 6, 507-512,June 2005 Rajewsky K.,Gu H., Kühn R., “Perspectives Series: Molecular Medicine in Genetically Engineered Animals”, Clinical Investigation. vol. 97, 1996 Thomas, K.R., and M.R. Capecchi, “Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells”, Cell, 51:503–512, 1987 Tronche F., Casanova E. et.al., “When reverse genetics meets physiology: the use of site-specific recombinases in mice”, FEBS Letters, 529:116-121, 2002

19 19 Βιβλιογραφία Μπεϊνά Σοφία, 2009 1818 Zhang C., Kitsberg D., Chy H.,et.al., “Transposon-mediated generation of targeting vectors for the production of gene knockouts”, Nucleic Acids Research, 33(3):e24, 2005 http://en.wikipedia.org/wiki/Gene_targeting http://www.vegabiolab.com http://www.genome.gov http://genome.wellcome.ac.uk http://www.biotech.wisc.edu http://www.bio.purdue.edu/research/groups/tmcf/tmcfko.htm http://ko.cwru.edu/services/targeting.html http://www.cgm.northwestern.edu/

20 20 Μπεϊνά Σοφία sofia.beina@gmail.com