Τεχνικές διαχωρισμού

Ανομοιογενές μείγμα (κολλοειδές) Tαξινόμηση της ύλης Ομοιόμορφες ιδιότητες; Όχι Ναι Σταθερή σύσταση; Όχι Χημικά αποσυντιθέμενο; Όχι Ανομοιογενές μείγμα (κολλοειδές) Διάλυμα Στοιχείο Χημική ένωση

Διαχωρισμός μειγμάτων Κριτήριο διαχωρισμού – διαφορετικές ιδιότητες των ουσιών που βρίσκονται μέσα στο μείγμα Στρατηγική/πρωτόκολλο – διαδικασία που μπορεί να κάνει διάκριση μεταξύ των διαφόρων συστατικών με διαφορετικές ιδιότητες Ιδιότητες Πυκνότητα Μοριακό βάρος Πτητικότητα Διαλυτότητα Πολικότητα Φορτίο Αντιδραστικότητα

Χρωματογραφία Ηλεκτροφόρηση Φυγοκέντρηση Τεχνικές διαχωρισμού Χρωματογραφία Ηλεκτροφόρηση Φυγοκέντρηση

Κριτήριο διαχωρισμού οι διαφορετικές κινητικότητές τους Χρωματογραφία Διαδικασία με την οποία διαχωρίζονται οι διάφορες ουσίες ενός μείγματος Κριτήριο διαχωρισμού οι διαφορετικές κινητικότητές τους Οι ουσίες κατανέμονται μεταξύ δύο φάσεων οι οποίες πρακτικά δεν αναμιγνύονται   ΣΤΑΤΙΚΗ ΦΑΣΗ: Στρώμα στερεού ή υγρού ακινητοποιημένου σε στερεό υπόστρωμα ΚΙΝΗΤΗ ΦΑΣΗ: Ρευστό, υγρό ή αέριο που κινείται διαμέσου και κατά μήκος της στατικής φάσης

Χρωματογραφία Οι δυο φάσεις επιλέγονται έτσι ώστε τα συστατικά του δείγματος να κατανέμονται μεταξύ κινητής και στατικής φάσης σε διαφορετικό βαθμό Συντελεστής κατανομής Κ Κ = Cm/Cs Cm = συγκέντρωση της ουσίας στην κινητή φάση Cs = συγκέντρωση της ουσίας στην στατική φάση

Χρωματογραφία Πρώτη εφαρμογή: Michael Tswett (цвет, Ρώσος βοτανολόγος) 1903: Διαχωρισμός  φυτικών χρωστικών (χλωροφύλλες) Στατική φάση – ανθρακικό ασβέστιο CaCO3 Κινητή φάση – πετρελαϊκός αιθέρας Μέσο – γυάλινη στήλη

Χρωματογραφία Κινητή φάση Στατική φάση «Φόρτωμα» μείγματος Η κινητή φάση εισέρχεται στη στατική φάση Τα συστατικά του μείγματος κατανέμονται μεταξύ των δύο φάσεων Η κίνηση της κινητής φάσης παρασύρει (εκλούει) τα συστατικά του μείγματος με διαφορετική ταχύτητα το καθένα (διαφορετικές ιδιότητες) Στο τέλος έχει επιτευχθεί ο διαχωρισμός των συστατικών του μείγματος

Τα συστατικά κατανέμονται στην κινητή και στη στατική φάση Χρωματογραφία Τα συστατικά κατανέμονται στην κινητή και στη στατική φάση Το κλάσμα που βρίσκεται στην κινητή φάση κινείται με την ταχύτητα που κινείται η κινητή φάση Το κλάσμα που βρίσκεται στην στατική φάση δεν κινείται

Θεωρητικές στοιβάδες (Theoretical Plates) Το μοντέλο των στοιβάδων θεωρεί τη διαδικασία της χρωματογραφίας ως ένα σύνολο πολλών ξεχωριστών θεωρητικών λωρίδων (στοιβάδων) Η κινητή φάση μετακινείται κατά τη διάρκεια της χρωματογραφίας – αντίστοιχο με την μετακίνηση από τη μια στοιβάδα στην επόμενη Σε καθεμιά από τις λωρίδες λαμβάνει χώρα ξεχωριστή ισορροπία του συστατικου μεταξύ της στατικής και της κινητής φάσης Η ποσότητα που βρίσκεται στην κινητή φάση μετακινείται στην επόμενη στοιβάδα και λαμβάνει χώρα νέα ισορροπία Ο αριθμός των θεωρητικών στοιβάδων σε μια συγκεκριμένη χρωματογραφική στατική φάση δεν είναι σταθερός Εξαρτάται από παράγοντες όπως: η φύση και η ταχύτητα της κινητής φάσης, η φύση του συστατικού, κινητικοί παράγοντες που επηρεάζουν την κατανομή (πίεση, θερμοκρασία)

Συσκευή Craig Craig’s apparatus Κινητή φάση Στατική φάση

Θεωρητικές στοιβάδες (Theoretical Plates) Έστω ότι η κατανομή του συστατικού Α μεταξύ κινητής και στατικής φάσης είναι 1 προς 1 (50-50) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 50 50 Το 50 που βρίσκεται στην κινητή φάση μετακινείται στην επόμενη στοιβάδα Νέα ισορροπία στην στοιβάδα 1 και στη στοιβάδα 2 Μετακίνηση της κινητής φάσης από την 1 στη 2 και από τη 2 στην 3 25 25 25 25 Νέα ισορροπία στην στοιβάδα 1, 2 και 3 Μετακίνηση κινητής φάσης από 1 σε 2, από 2 σε 3, από 3 σε 4 12,5 12,5 25 25 12,5 12,5 Νέα ισορροπία στην στοιβάδα 1, 2, 3 και 4 Μετακίνηση κινητής φάσης.... 6,25 6,25 6,25 6,25 18,75 18,75 18,75 18,75 1 2 3 4

Έστω ότι έχουμε δύο συστατικά Α και Β Θεωρητικές στοιβάδες (Theoretical Plates) Έστω ότι έχουμε δύο συστατικά Α και Β Η κατανομή του Α μεταξύ κινητής και στατικής φάσης είναι 1 προς 1 (50-50) Η κατανομή του Β μεταξύ κινητής και στατικής φάσης είναι 9 προς 1 (90-10) Α Β 50 50 90 10 Η κίνηση του Α διαμέσου του υλικού χρωματογραφίας έιναι πιο αργή σε σχέση με την κίνηση του Β 25 25 9 1 25 25 81 9 25 25 72,9 8,1 12,5 12,5 0,9 0,1 16,2 1,8 12,5 12,5 ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ!! 6,25 6,25 0,09 0,01 2,43 0,27 18,75 18,75 18,75 18,75 21,87 2,43 6,25 6,25 65,617,29 1 2 3 4

Θεωρητικές στοιβάδες (Theoretical Plates) http://www.chem.uoa.gr/Applets/AppletCraig/Appl_Craig2.html

Λόγος μετώπου ή συντελεστής ανάσχεσης Rf Απόσταση που διανύθηκε από το διαλύτη (κινητή φάση)   Για χρωματογραφίες που έχουν γίνει με τις ίδιες κινητές φάσεις και για τον ίδιο χρόνο, το Rf είναι το ίδιο για την ίδια ουσία Είναι χαρακτηριστικός για κάθε ουσία Βοηθά στο καθορισμό του είδους της

Μηχανισμοί ανάσχεσης Διαφορετική προσρόφηση των συστατικών στην στατική φάση Διαφορετική κατανομή των συστατικών μεταξύ στατικής και κινητής φάσης Έλξη ή απώθηση των διαφορετικών συστατικών από τη στατική φάση ανάλογα με το φορτίο Αποκλεισμός συσκεκριμένων συστατικών από τη στατική φάση Πρόσδεση συστατικού σε περιοχή εξειδικευμένη μόνο για το συγκεκριμένο συστατικό (ακινητοποιημένος προσδέτης)

Μηχανισμοί ανάσχεσης

Εύρεση αριθμού συστατικών ενός μίγματος Ταυτοποίηση ενώσεων Εφαρμογές Εύρεση αριθμού συστατικών ενός μίγματος Ταυτοποίηση ενώσεων Έλεγχος καθαρότητας Παρακολούθηση μιας αντίδρασης Ποιοτικός έλεγχος προϊόντων Ανίχνευση ουσιών κλπ

Κατηγοριοποίηση χρωματογραφίας Γίνεται ανάλογα με: Την φύση της στατικής και κινητής φάσης στερεού - υγρού, υγρού – υγρού, υγρού – αερίου Την μορφή της στατικής φάσης στήλης, λεπτής στοιβάδας, χαρτιού Το μηχανισμό διαχωρισμού προσρόφησης, κατανομής, ανταλλαγής

Χρωματογραφία επίπεδη Χρωματογραφία – είδη με βάση το σχήμα του bed Χρωματογραφία στήλης Χρωματογραφία επίπεδη

Χρωματογραφία στήλης Τεχνική διαχωρισμού Στατική φάση «πακεταρισμένη» σε σωληνοειδή στήλη Η στήλη μπορεί να είναι γεμάτη με το υλικό της στατικής φάσης (packed column) ή να περιέχει το υλικό στα τοιχώματά της αφήνοντας ένα ανοιχτό μονοπάτι για την κινητή φάση (open tubular column) Οι ταχύτητες με τις οποίες κινούται τα διάφορα συστατικά του μείγματος εμφανίζονται ως διαφορετικά Rf

Χρωματογραφία στήλης

Διαχωρισμός με χρωματογραφία στήλης

Διαχωρισμός με χρωματογραφία στήλης

Διαχωρισμός με χρωματογραφία στήλης

Συλλογή κλασμάτων Καθώς η κινητή φάση φτάνει στο τέλος της στήλης, θα πρέπει να συλλέγεται σε μικρές ποσότητες (κλάσματα) Το καθένα από τα κλάσματα αυτά θα περιέχει και διαφορετικές αναλογίες συστατικών λόγω του διαχωρισμού τους στη στήλη Τα αρχικά κλάσματα περιέχουν συστατικά που εκλούονται νωρίτερα Τα τελικά κλάσματα περιέχουν συστατικά που εκλούονται αργότερα Δυνατότητα αποθήκευσης των κλασμάτων Δυνατότητα ένωσης κάποιων κλασμάτων Δυνατότητα δοκιμασίας των κλασμάτων για αναγνώριση συστατικού που μας ενδιαφέρει

Συλλογή κλασμάτων Όγκος κλασμάτων 0,5, 1,0, 2,0, 5,0ml ... Αριθμός κλασμάτων Ανάλογα με την τεχνική, με τον όγκο του δείγματος, με τα συστατικά του μείγματος, με το ύψος της στήλης Αυτοματοποιημένος συλλέκτης κλασμάτων Συλλογή καθορισμένου όγκου ανά κλάσμα

Άξονας ΧΧ’ συνήθως αριθμός κλάσματος ή όγκος έκλουσης Το χρωματογράφημα Ο πιο απλός και εύκολα ερμηνέψιμος τρόπος παρουσίασης των αποτελεσμάτων της χρωματογραφίας είναι το χρωματογράφημα Γραφική παράσταση Άξονας ΧΧ’ συνήθως αριθμός κλάσματος ή όγκος έκλουσης Άξονας ΥΥ’ κάποια μετρήσιμη παράμετρος του δείγματος (συνήθως απορρόφηση σε κάποιο λ ή φθορισμός)

Τι πληροφορίες μπορούμε να πάρουμε από το χρωματογράφημα; Το χρωματογράφημα Τι πληροφορίες μπορούμε να πάρουμε από το χρωματογράφημα; Κάθε διαφορετική κορυφή στο χρωματογράφημα αντιστοιχεί και σε ένα διαφορετικο συστατικό του μείγματος Όσο πιο πολύπλοκό έιναι το μείγμα τόσο περισσότερες κορυφές θα υπάρχουν στο χρωματογράφημα Ποιοτικός προσδιορισμός σύστασης μείγματος με σύγκριση των θέσεων της κάθε κορυφής με πρότυπα δείγματα (standards) Ποσοτικός προσδιορισμός του κάθε συστατικού με σύγκριση των εμβαδών των κορυφών

Όγκος και χρόνος ανάσχεσης Όγκος ανάσχεσης ή όγκος έκλουσης (VR) Όγκος που απαιτείται για εκλουσθεί ένα συστατικό από τη στήλη CV = column volumes Χρόνος ανάσχεσης ή χρόνος έκλουσης (tR) Χρόνος που απαιτείται για να εκλουσθεί ένα συστατικό από τη στήλη υπό σταθερή ροή VR= tR x ροή

Ν1/2 [tR(B) - tR(A)] 2 [tR(B) + tR(A)] Απόδοση στήλης Σημαντική παράμετρος εκτός από τον όγκο και τον χρόνο έκλουσης είναι το πλάτος της κορυφής (W) Η απόδοση της στήλης στην ανάλυση μεταξύ δύο διαδοχικών κορυφών (R) δίνεται από τον τύπο R = [2(tR(B) - tR(A))]/[W(A) + W(B)] Η απόδοση της στήλης για την ανάλυση μιας ουσίας μετράται από τη σκοπιά του αριθμού των θεωρητικών στοιβάδων (N) N=16(tR/W)2  W = 4tR/Ν1/2 Αντικαθιστώντας έχουμε   Ν1/2 [tR(B) - tR(A)] R = 2 [tR(B) + tR(A)]

Απόδοση στήλης Είναι συνήθως δύσκολο να προσδιοριστεί η αρχή και το τέλος μιας κορυφής με ακρίβεια Χρησιμοποιούμε το πλάτος της κορυφής στο μισό του ύψους της (W0.5h) Ευκολότερο να μετρηθεί με ακρίβεια τότε  N=5.54(tR /W0.5h)2 Θεωρούμε ότι οι κορυφές ακολουθούν κατανομή Gauss (συμμετρικές)

Απόδοση στήλης Σύγκριση δύο κορυφών με διαφορετικό ύψος Σύγκριση της ίδιας κορυφής υπό διαφορετικές συνθήκες χρωματογραφίας Ισοδύναμο ύψους της θεωρητικής στοιβάδας [Height Equivalent to a Theoretical Plate (HETP)]  HETP =LN   L = ύψος στήλης σε cm Υψηλό Ν ή/και χαμηλό HETP = μεγαλύτερη απόδοση στήλης

Καλύτερος διαχωρισμός??? Απόδοση στήλης Ο όγκος της κινητής φάσης είναι ανάλογος με το μήκος της στήλης Ο χρονος έκλουσης αυξάνεται Θεωρητικά, μια στήλη απέιρου μήκους θα μπορούσε να διαχωρίσει καλύτερα άπειρα συστατικά του μείγματος Καλύτερος διαχωρισμός??? Όχι διότι παρατηρείται πλάτυνση της ζώνης του δείγματος καθώς μετακινείται μέσα στη στήλη Πλατύτερη κορυφή στο χρωματογράφημα Το πλάτος της κορυφής είναι ανάλογο με το τετράγωνο του μήκους της στήλης

Χρωματογραφία E D C Β Α http://www.chem.uoa.gr/Applets/AppletChrom/Appl_Chrom2.html

Χρωματογραφία D E C Α Β http://www.chem.uoa.gr/Applets/AppletChrom/Appl_Chrom2.html

Χρωματογραφία D C E Β Α http://www.chem.uoa.gr/Applets/AppletChrom/Appl_Chrom2.html

Χρωματογραφία D E C Α Β http://www.chem.uoa.gr/Applets/AppletChrom/Appl_Chrom2.html

Ανίχνευση συστατικού Ανάγκη ύπαρξης κάποιας μεθόδου παρατήρησης/μέτρησης των συστατικών καθώς διαχωρίζονται από τη χρωματογραφική μέθοδο Καταστρεπτικές vs. μη-καταστρεπτικές Γενικές vs. Εξειδικευμένες On-line με τη στήλη vs. σε ξεχωριστό βήμα

Ιδιότητες ιδανικού ανιχνευτή Ανίχνευση συστατικού Ιδιότητες ιδανικού ανιχνευτή Υψηλή ευαισθησία/επιλεκτικότητα στο σήμα των συστατικών Χαμηλή ευαισθησία σε διακυμάνσεις ροής, πίεσης και θερμοκρασίας Ταχύτητα απόκρισης σε διαφορές συγκέντρωσης Σταθερή σε θόρυβο Γραμμική εμβέλεια Ευκολία στην ερμηνεία και τον χειρισμό του σηματος

Ανίχνευση συστατικού

Επίπεδη χρωματογραφία Η στατική φάση είναι παρούσα σε επίπεδο ή ώς επίπεδη επιφάνεια Το επίπεδο μπορεί να είναι χαρτί (χρωματογραφία χάρτου) εξυπηρετεί το ρόλο της στατικής φάσης είτε μόνο του είτε εμποτισμένο με υλικό Μπορεί να είναι ένα λεπτό στρώμα στερεού υλικού πάνω σε μια επίπεδη (γυάλινη) επιφάνεια χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας Ομοίως διαφορετικά συστατικά διανύουν διαφορετικές αποστάσεις Εξαρτάται από την ισχυρότητα των αλληλεπιδράσεων με την στατική και την κινητή φάση Τα (Rf) χρησιμοποιούνται για την ταυτοποίηση του αγνώστου μείγματος

Χρωματογραφία Η κίνηση των συστατικών ενός μείγματος στην επίπεδη χρωματογραφία εξαρτάται από δύο παραμέτρους Η διαλυτότητα του κάθε συστατικού στην κινητή φάση Υψηλή διαλυτότητα στην κινητή φάση συνεπάγεται γρήγορη κίνηση του συστατικού Η προσρόφηση του συστατικού στην στατική φάση Υψηλή προσρόφηση συνεπάγεται αργή κίνηση του συστατικού Τα συστατικά του μείγματος διαφέρουν στην διαλυτότητα και προσροφητικότητα Διαφορετική ταχύτητα μετακίνησης κάθε συστατικού στο μέσο χρωματογραφίας

Την φύση της στατικής και κινητής φάσης Χρωματογραφία – είδη με βάση τη φύση των φάσεων Την φύση της στατικής και κινητής φάσης στερεού – υγρού υγρού – υγρού υγρού – αερίου

Χρωματογραφία – είδη με βάση τη φυσική κατάσταση των φάσεων

Υγρή χρωματογραφία (LC) Χρωματογραφία – είδη με βάση τη φυσική κατάσταση της κινητής φάσης Χρωματογραφία αερίου Gas chromatography (GC) ή Gas-Liquid chromatography (GLC) Η κινητή φάση είναι στην αέρια μορφή Πάντοτε διεξάγεται σε στήλη Υγρή χρωματογραφία (LC) Η κινητή φάση είναι στην υγρή μορφή Σε στήλη ή σε επίπεδο Σύγχρονες μέθοδοι υγρής χρωματογραφίας Μικρές ποσότητες στατικής φάσης και δείγματος Υψηλή πίεση Ηigh performance liquid chromatography (HPLC)

Χρωματογραφία – είδη με βάση το μηχανισμό διαχωρισμού ΠΡΟΣΡΟΦΗΣΗ: Δυνάμεις μοριακής φύσης (ρευστό επί στερεού) ΚΑΤΑΝΟΜΗ: Διαφορά στη διαλυτότητα (υγρό επί υγρού) ΑΝΤΑΛΛΑΓΗ/ΑΝΤΙΚΑΤΑΣΤΑΣΗ: Δυνάμεις ιοντικής φύσεως (υγρό επί στερεού)