2o ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ Καλλιέργειες

Εscherichia coli

Καλλιέργειες πολλαπλασιασμός μικροοργανισμών in vitro (1) Βακτήρια - ταχέως/εύκολα αναπτυσσόμενα - δύσκολα αναπτυσσόμενα - ουδόλως αναπτυσσόμενα in vitro (2) Μύκητες: παρομοίως ( δυσκολίες) (3) Ιοί: απαιτούν συστήματα κυτταροκαλλιεργειών (4) Παράσιτα: αναγνώριση παρουσίας τους κυρίως με χρώσεις

Καλλιέργειες Βακτηρίων και Μυκήτων Διάκριση Θρεπτικών Υλικών Ανάλογα με την Σύσταση υγρά, στερεά, ημίρρευστα Ανάλογα με την Σύνθεση  κοινά (ζωμός και άγαρ) ειδικά (εμπλουτισμένα, εκλεκτικά, διαχωριστικά)

Κύρια Συστατικά των Θρεπτικών Υλικών Άγαρ και άλλες στερεωτικές ουσίες φυτική ουσία που παράγεται από τον Ροδόφυκα πολυσακχαρίτες στερεά ενωμένοι με άλατα ασβεστίου δεν αποτελεί τροφή για τα μικρόβια, δεν διασπάται από τα ένζυμά τους λειώνει στους 800C και πήζει στους 300C Πεπτόνες βιομηχανικά προϊόντα διάσπασης λευκωματούχων ουσιών ζωικής ή φυτικής προέλευσης η ποσοτική και ποιοτική τους σύσταση διαφέρει (τρόπος παρασκευής) παραδείγματα: τρυπτόζη, τρυπτόνη, πρωτεόζη Εκχυλίσματα κρέατος και άλλων ιστών (Beef Extract) - προϊόντα βρασμού κρέατος ή ιστών σε νερό Εκχυλίσματα μυκήτων (Yeast Extract)

Κύρια Συστατικά των Θρεπτικών Υλικών Σάκχαρα προστίθενται ως τροφή για την ενίσχυση ανάπτυξης προστίθενται για την μελέτη βιολογικών ιδιοτήτων μονοσακχαρίτες, δισακχαρίτες, τρισακχαρίτες, πολυσακχαρίτες, γλυκοσίδες, πεντόζες Αναγωγικές ουσίες προστίθενται για τη δημιουργία αναερόβιου περιβάλλοντος θειογλυκολικό νάτριο, κυστεϊνη, ασκορβικό οξύ Εκλεκτικές ουσίες ή μίγματα ενσωματώνονται στη φάση παρασκευής του υλικού χρωστικές (κρυσταλλικό ιώδες), άλατα (NaCl, σεληνίτης), αντιβιοτικά Χρωματομετρικοί δείκτες ουσίες που αλλάζουν χρώμα όταν μεταβληθεί το pΗ του διαλύματος χρησιμοποιούνται ως δείκτες μεταβολής του pΗ στα καλλιεργήματα κυανό της βρωμοφαινόλης, ουδέτερο ερυθρό

Διάκριση ανάλογα με την Σύσταση Υγρά Θρεπτικά Υλικά Τα θρεπτικά συστατικά είναι διαλυμένα σε απεσταγμένο νερό Αλκαλικό πεπτονούχο νερό, θρεπτικός ζωμός, θειογλυκολικός ζωμός, ζωμός Mueller-Hinton Στερεά Θρεπτικά Υλικά Θρεπτικά συστατικά διαλυμένα σε νερό και άγαρ (1.5-2%) Αιματούχο άγαρ, σοκολατόχρωμο άγαρ, MacConkey άγαρ, Thayer-Martin άγαρ, Salmonella-Shigella άγαρ, Mueller-Hinton άγαρ Ημίρρευστα Θρεπτικά Υλικά Θρεπτικά συστατικά διαλυμένα σε νερό και άγαρ (0.5%) Μotility άγαρ

Διάκριση ανάλογα με την Σύνθεση Εμπλουτισμένα Θρεπτικά Υλικά περιέχουν τα συστατικά των κοινών θρεπτικών υλικών εμπλουτισμένα με αίμα, ορό αίματος, πρωτεΐνες, αμινοξέα ή σάκχαρα αιματούχο άγαρ σοκολατόχρωμο Εκλεκτικά Θρεπτικά Υλικά περιέχουν ουσίες που επιτρέπουν την ανάπτυξη ενός είδους βακτηρίου αναστέλλοντας ταυτόχρονα την ανάπτυξη άλλων ειδών διευκολύνεται η απομόνωση ενός συγκεκριμένου είδους MacConkey άγαρ, Thayer-Martin άγαρ Διαχωριστικά Θρεπτικά Υλικά περιέχουν ουσίες (κυρίως σάκχαρα) που επιτρέπουν το μακροσκοπικό διαχωρισμό των αποικιών ομάδων βακτηρίων MacConkey άγαρ (περιέχει λακτόζη): κόκκινες ή άχρωμες αποικίες Συντηρητικά Θρεπτικά Υλικά περιέχουν ουσίες που επιτρέπουν την επιβίωση των κυττάρων για μεγάλο χρονικό διάστημα υλικό μεταφοράς Stuart

→ Απομόνωση, ταυτοποίηση,αντιβιόγραμμα Εξέταση Καλλιεργειών → Απομόνωση, ταυτοποίηση,αντιβιόγραμμα Ανάπτυξη μικροοργανισμών με μορφή «αποικιών» Μακροσκοπικά χαρακτηριστικά αποικιών - ένα ή περισσότερα βακτήρια ?? Κλινικά δείγματα με ή χωρίς φυσιολογική χλωρίδα - ΕΝΥ, αρθρικό υγρό ↔ κόπρανα, ούρα, πτύελα Συχνά, μικτό καλλιέργημα: μικτές αποικίες → ποικιλία τύπων αποικιών (μορφολογιών) Απομόνωση μικροοργανισμού με ανακαλλιέργεια

Μορφολογία Αποικιών (μακροσκοπική εξέταση) Χαρακτηριστικά που βοηθούν στην ταυτοποίηση: Μέγεθος: διάμετρος σε mm Σχήμα: κυκλικό, ριζοειδές, νηματοειδές, ατρακτοειδές, ακανόνιστο Υψος: επίπεδο, καμπύλο, με ομφαλό Περιφέρεια: ολόκληρη, λοβώδης, οδοντωτή, ελικοειδής Χρώμα: άσπρο, κίτρινο, μαύρο, πορτοκαλί, μπεζ, άλλη Επιφάνεια: γυαλιστερή, θαμπή, άλλη Πυκνότητα: αδιαφανής, ημιδιαφανής, διαφανής Σύσταση: κρεμώδης, μεμβρανώδης, ιξώδης, εύθρυπτη Οσμή (Pseudomonas: χυμός σταφυλιού, Proteus: καμμένη σοκολάτα, Eikenella corrodens: χλωρίνη, CDC EF-4: ποπκορν) Χρόνος ανάπτυξης αποικίας

Ανίχνευση Αιμόλυσης στο Αιματούχο Αγαρ α-αιμόλυση: μερική αιμόλυση (πράσινος χρωματισμός του άγαρ) β-αιμόλυση: πλήρης αιμόλυση (διαύγαση, «φωτοστέφανο») γ-αιμόλυση: απουσία αιμόλυσης Παραγωγή Χρωστικής στο Αγαρ Υδατοδιαλυτή χρωστική που διαχέεται στο άγαρ (πυοκυανίνη, φθορίζουσες χρωστικές) Χρωστική που δεν διαχέεται (χρωματισμός αποικίας) Αλλαγές σε διαχωριστικά καλλιεργητικά μέσα Χρωστικές, δείκτες pH, άλλες ουσίες: ενσωμάτωση σε διαχωριστικά καλλιεργητικά μέσα ως δείκτες ενζυμικής ενεργότητας (→ ταυτοποίηση)

Εξέταση PYR (L-pyrrolidonyl-β-naphthylamide) Αμεσες βιοχημικές εξετάσεις για την προκαταρκτική ταυτοποίηση βακτηρίων σε καλλιέργειες Εξέταση καταλάσης Μεταφορά αποικίας σε αντικειμενοφόρο πλάκα Ενστάλλαξη σταγόνων H2O2 Παρουσία καταλάσης: παραγωγή Ο2 Θετικό τεστ: εμφάνιση αφρού (μπουρμπουλήθρες) Ταυτοποίηση Staphylococcus (+) [Streptococcus (-)] Εξέταση πηκτάσης Ταυτοποίηση Staphylococcus aureus Εξέταση οξιδάσης Ταυτοποίηση Pseudomonas Εξέταση PYR (L-pyrrolidonyl-β-naphthylamide) Ταυτοποίηση Enterococcus

Ταυτοποίηση Στελέχους Αρχικά: προκαταρκτική ταυτοποίηση → μορφολογία αποικιών + χρώση Gram + ταχέα tests οριστική ταυτοποίηση σε επίπεδο γένους και είδους: προσδιορισμός μεγάλου αριθμού βιοχημικών χαρακτηριστικών Ημιαυτόματα ή πλήρως αυτοματοποιημένα εμπορικά συστήματα (αναλυτές)

Σύστημα Vitek (Biomerieux)

Σύστημα Vitek (Biomerieux)

Σύστημα Vitek (Biomerieux)

Σύστημα Phoenix (Becton Dickinson)

Σύστημα Phoenix (Becton Dickinson)

Blood agar plate (BAP)

Εscherichia coli

Μορφολογία Αποικιών

Τύποι αιμόλυσης: α, β, γ

α-αιμόλυση (πράσινη)

β-αιμόλυση

γ-αιμόλυση β-αιμόλυση

McConkey Agar

Hektoen Enteric Agar Κόπρανα: φυσιολογική χλωρίδα μαζί με Salmonella

Hektoen Enteric Agar Salmonella enterica Shigella flexneri

Streptococcus pneumoniae

S. aureus Mycobacterium smegmatis Lactobacillus Streptomyces albus

Bacillus licheniformis Bacillus cereus Bacillus anthracis

Kurthia Nocardia asteroides

Mannitol salt agar S. epidermidis A: S. aureus B: S. epidermidis C: E. coli