Jieun Kim et al., “Memory recall and modifications by activating neurons with elevated CREB” Εργασία: Παρουσίαση άρθρου Βαγγέλης Χρήστου ( Α.Μ.: 5328 ) Ημερομηνία παρουσίασης: 17/05/2014 ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ Μάθημα: Μοριακές Ασθένειες (επιλογής δ’ εξαμήνου) Υπεύθυνη μαθήματος: Μαρία Φράγκου

α) CREB: cAMP response-element binding protein β)TRPV1: transient receptor potential cation channel subfamily V member1 γ) GFP: green fluorescent protein

CREB ●Eίναι κυτταρικός μεταγραφικός παράγοντας ●Oμοδιμερές, με κατάλοιπα λευκίνης τοποθετημένα στην εσωτερική πλευρά της α- έλικας σχηματίζοντας το μοτίβο σύνδεσης ‘zip’ ●Ελέγχει τη μεταγραφή γονιδίων σημαντικών μορίων π.χ. BDNF, c-fos, CRH, υδροξυλάση της τυροσίνης

TRPV1 Μη ειδικός κατιοντικός δίαυλος που ενεργοποιείται από πλήθος εξωγενών και ενδογενών ερεθισμάτων (φυσικών,χημικών) ●Εξωγενείς ενεργοποιητές είναι η υψηλή θερμοκρασία και η καψαϊκίνη (καυτές πιπεριές) ●Ενδογενείς ενεργοποιητές είναι το χαμηλό ph H ενεργοποίησή του οδηγεί σε πόνο και καυτή αίσθηση

GFP ●H πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη αποτελείται από 238 αμινοξέα και εκπέμπει πράσινο φθορίζων χρώμα όταν εκτίθεται σε υπεριώδη ακτινοβολία. ●Στην κυτταρική και μοριακή βιολογία χρησιμοποιείται ως αναφορέας έκφρασης ενός επιθυμητού γονιδίου. ●Το γονίδιο του GFP εισάγεται και διατηρείται στο γένωμα των οργανισμών συνήθως μέσω ιϊκού φορέα.

Εισαγωγικά Η μνήμη αντιπροσωπεύεται από ένα σύνολο νευρώνων, διεσπαρμένων στον εγκέφαλο, που συνιστούν ένα “ίχνος” μνήμης. Περιοχές νευρώνων της πλάγιας αμυγδαλής που εκφράζουν υψηλά επίπεδα CRΕΒ, κατέχουν σημαντικό ρόλο για την εγγραφή μνήμης φόβου και συμμετέχουν τόσο στην ανάκλησή της όσο και στην τροποποίησή της.

Εισαγωγικά Κατά τη διάρκεια συνθηκών φόβου, περίπου το 70% των νευρώνων της πλάγιας αμυγδαλής δέχεται αισθητικές πληροφορίες, ενώ μόνο ένα ποσοστό περίπου 25% συμμετέχει σε μία διαδικασία μαθησιακής νευροπλαστικότητας. ● Η επανενεργοποίηση υποπληθυσμών νευρώνων που ήταν ενεργοί στη διάρκεια της εκπαίδευσης, σε σημαντικό βαθμό ενδυναμώνει την νεοαποκτηθείσα ανάμνηση.

Ερώτημα Αρκεί όμως η ενεργοποίηση συγκεκριμένης ομάδας νευρώνων στην αμυγδαλή για να γίνει ανάκληση αναμνήσεων φόβου αλλά και να τροποποιηθούν ήδη εγκατεστημένες μνήμες φόβου π.χ. αναδιοργάνωση (reconsolidation) ή και ενίσχυση; Για να απαντήσουν αυτό το ερώτημα, οι Kim et al. στην παρούσα έρευνα διέγειραν τεχνητά μία υποομάδα νευρώνων με υψηλά επίπεδα CREB (μέσω φαρμακευτικού ελέγχου της νευρωνικής ενεργοποίησης- καψαϊκίνη).

Στοχευμένη διέγερση ● Καταρχάς οι ερευνητές για να πετύχουν τη στοχευμένη διέγερση, στόχευσαν στην έκτοπη έκφραση των υποδοχέων καψαϊκίνης (TRPV1)γηξ σε εγκεφάλους ποντικών. ● Δημιούργησαν μία συνθετική CREB-GFP πρωτεΐνη μαζί με τον TRPV1 και στόχευσαν στα νευρωνικά κύτταρα της αμυγδαλής, που εκφράζουν υψηλά επίπεδα CREB. ● Για να επιτύχουν τη συνέκφραση χρησιμοποίησαν τον herpes simplex virus HSV

Στοχευμένη Διέγερση ●Η συνθετική CREB-TRPV1 πρωτεΐνη περιέχει ξεχωριστό υποκινητή για κάθε γονίδιο. Επίσης δημιουργήθηκαν και κατάλληλα μόρια control. ●Αφού επιβεβαιώθηκε η επιτυχής έκφραση του έκτοπου υποδοχέα TRPV1, έπρεπε να ελέγχθηκε και επιβεβαιώθηκε ότι η καψαϊκίνη μπορεί να δράσει και να ενεργοποιήσει παροδικά τους νευρώνες αυτούς.

Ανάκληση Μνήμης

●Καθώς η καψαΐκίνη προκάλουσε ‘πάγωμα’ πολύ γρήγορα και με πολύ μεγάλη συχνότητα στα ποντίκια που τους έγινε ένεση με CREB-TR, οι επιστήμονες κατάφεραν και απέδειξαν ότι: Το ‘πάγωμα’ των ποντικών που επάγεται με την καψαϊκίνη είναι πολύ ειδικό και αφορά την ενεργοποίηση νευρώνων με αυξημένη έκφραση CREB. Υπογραμμίζεται έτσι η πολύ μεγάλη ειδικότητα της καψαϊκίνης για την ανάκληση μνήμης φόβου.

Αναδιοργάνωση Μνήμης Όταν ανακαλείται η μνήμη φόβου, μετά διέρχεται σε μία ασταθή κατάσταση που απαιτεί πρωτεϊνοσύνθεση για την αναδιαμόρφωσή της. ●Στη συνέχεια οι επιστήμονες αφού πραγματοποίησαν την προηγούμενη διαδικασία, χορήγησαν στο πέρας της έναν αναστολέα της πρωτεϊνοσύνθεσης, την ανισομυκίνη. ●Την επόμενη μέρα ξαναπραγματοποίησαν το τεστ μνήμης και παρατήρησαν ότι το ‘πάγωμα’ μειώθηκε σε πολύ μεγάλο βαθμό.

Μοριακός μηχανισμός Στη συνέχεια οι επιστημόνες ανακάλυψαν ότι ο μηχανισμός που σχετίζεται με την ενεργοποίηση των νευρώνων με υψηλά ποσοστά CREB κατά τη διάρκεια του φόβου και την αναδιαμόρφωση της μνήμης είναι η φωσφορυλίωση του υποδοχέα 1 του GluA1 στη Ser845. ●Ο GluA είναι ένας υποδοχέας γλουταμικού που βρίσκεται στις νευρικές συνάψεις στην πλάγια αμυγδαλή. Το πείραμα που πραγματοποίησαν ήταν όπως και το αρχικό, μόνο που 30min μετά από την έγχυση της καψαϊκίνης απομόνωσαν τον ιστό της αμυγδαλής και μέτρησαν τα επίπεδα της ολικής(tGluA1) και της φωσφορυλιωμένης (pGluA1) με West blotting.

Μοριακός μηχανισμός Βρήκαν ότι τα επίπεδα της pGluA1 έχουν σημαντικά αυξηθεί μετά την χορήγηση της καψαϊκίνης, ενώ δεν εμφανίστηκε καμία σημαντική αλλαγή στην ποσότητα της tGluA1. Άρα Η φωσφορυλίωση της GluA1 στη Ser845 φαίνεται να είναι μοριακός μηχανισμός- ‘κλειδί’ στις διαδικασίες ανάκλησης και αναδιοργάνωσης στις συνάψεις της πλάγιας αμυγδαλής.

Πολλαπλή ενεργοποίηση Η πολλαπλή επανενεργοποίηση ενός μνημονικού εγγράμματος ίσως είναι σημαντική για την ενίσχυσή του. Δεδομένου ότι είναι η ενεργοποίηση νευρώνων CREB που επιτυγχάνουν την ανάκληση μνήμης φόβου, οι ερευνητές θέλησαν να εξετάσουν εάν η (πολλαπλή) ενεργοποίηση αυτών των νευρώνων θα οδηγήσει απευθείας σε ενίσχυση της συγκεκριμένης ανακληθείσας μνήμης φόβου. Για να το ελέγξουν αυτό, χορήγησαν καψαϊκίνη επί 3 διαδοχικές μέρες...

Πολλαπλή ενεργοποίηση Αποτέλεσμα: Η επανάληψη οδηγεί πράγματι σε μεγαλύτερα ποσοστά ‘παγώματος’ ως αντίδραση στο ακουστικό ερέθισμα.

Εξασθένιση με τον χρόνο;; Ελέγχθηκε επίσης το ενδεχόμενο η παρέλευση του χρόνου από μόνη της να εξασθενίζει τη μνήμη - άρα μήπως η καψαϊκίνη απλώς εμποδίζει αυτή την εξασθένιση αντί να ενισχύει πραγματικά τη μνήμη;

Εξασθένιση με τον χρόνο;; Βρέθηκε όμως ότι η μνήμη του φόβου δεν εξασθενίζει με τον χρόνο, και μάλιστα μία μόνη επανενεργοποίηση δεν έχει σημαντικό ενισχυτικό αποτέλεσμα.

Συμπέρασμα Με το άρθρο αυτό για πρώτη φορά αποδεικνύεται ότι η τεχνητή ενεργοποίηση μιας υποομάδας νευρώνων που εμφάνιζαν υψηλά επίπεδα CREB κατά τη διάρκεια της εκπαίδευσης στο ερέθισμα του φόβου επαρκεί για την ανάκληση αυτής της ανάμνησης. Επιπρόσθετα: Αποδεικνύεται ότι ο ίδιος χειρισμός επαρκεί για την επαναδιοργάνωση/ ενίσχυση της μνήμης. Άρα...

Συμπέρασμα Μπορούμε πλέον να μιλάμε για άμεση σύνδεση μεταξύ της ενεργοποίησης συγκεκριμένης ομάδας νευρώνων στην πλάγια αμυγδαλή και της ανάκλησης της μνήμης & επερχόμενων τροποποιήσεων σε αυτήν.

Ευχαριστώ για την προσοχή σας!!!