Structural and functional diversity generated by alternative mRNA splicing Jorg Stetefeld and Markus A. Ruegg Biozentrum, University Basel, Klingelbergstrasse 70, CH-4056 Basel, Switzerland Τριανταφύλλου Αλέξανδρος-Σταύρος Ιατρική Ιωαννίνων

Μάτισμα (Splicing) Διαδικασία ωρίμανσης mRNA- Απομάκρυνση ιντρονίων (introns) και συρραφή εξονίων (exons) Συντελείται από τα σωμάτια ματίσματος (spliceosomes) δηλ. συγκροτήματα πρωτεϊνών και RNA

Εναλλακτικό Μάτισμα (Alternative Splicing) Εύκολος τρόπος δημιουργίας μιας ποικιλίας πρωτεϊνών, οι οποίες είναι τροποποιήσεις ενός βασικού μοτίβου ανάλογα με το πρόγραμμα της ανάπτυξης του κυττάρου, χωρίς να απαιτούνται νέα γονίδια για κάθε πρωτεΐνη

Εισαγωγή Το εναλλακτικό μάτισμα αποτέλεσε την απάντηση για το μικρό αριθμό των ανθρώπινων γονιδίων ύστερα από την ολοκλήρωση του Προγράμματος του Ανθρώπινου Γονιδιώματος Τουλάχιστον το 50% των ανθρώπινων γονιδίων υφίστανται εναλλακτικό μάτισμα

Εισαγωγή Αξιοσημείωτο αποτελεί το παράδειγμα του γονιδίου που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη Dscam στα νευρικά κύτταρα της Drosophila melanogaster. Χάρη στο εναλλακτικό μάτισμα, από αυτό το γονίδιο και μόνο παράγονται 38.016 διαφορετικά mRNA, δηλ. 3 φορές περίπου ο αριθμός των γονιδίων του συγκεκριμένου είδους!

Εισαγωγή Ας δούμε συγκεκριμένα τα παραδείγματα των εξής πρωτεϊνών: Glutathione-S-tranferases (GSTs) Human Pyrophosphorylases (AGX) Wilms’ tumor-suppresor protein Picollo Agrin (G3)

GSTs (Glutathione-S-transferases)

GSTs (Glutathione-S-transferases) Πρωτεΐνες με σημαντικό ρόλο στην κυτταρική αποτοξίνωση μέσω της σύζευξης ξένων παραγόντων (πχ φάρμακα και εντομοκτόνα) με τη γλουταθειόνη (GSH, σημαντικός αντιοξειδωτικός παράγοντας)

GSTs Χάρη στο εναλλακτικό μάτισμα προκύπτουν 4 διαφορετικές GSTs στο κουνούπι Anopheles dirus species B (AdGST), το οποίο αποτελεί σημαντικό παράγοντα ελονοσίας στη νοτιοανατολική Ασία.

Λειτουργικές μεταβολές Η πρωτεΐνη AdGST1-4 (που έχει υποστεί εναλλακτικό μάτισμα) έχει ως ανταγωνιστικό αναστολέα τα πυρεθροειδή Σε αντίθεση με την AdGST1-3 ( η μορφή που δεν έχει υποστεί μάτισμα)

Αποτέλεσμα Η AdGST-4 παρέχει μηδαμινή προστασία στα κουνούπια από τα εντομοκτόνα, σε αντίθεση με την AdGST-3

Γιατί όμως? Συγκρίνοντας τα ενεργά κέντρα των δύο ενζύμων παρατηρούμε ότι είναι πανομοιότυπα (G-site στο οποίο προσδένεται η GSH και H-site το οποίο συμβάλλει στην αναγνώριση του υποστρώματος)

Τι συμβαίνει λοιπόν? Η διαφορά εντοπίζεται στο πενταπεπτίδιο που έχει προστεθεί στην AdGST1-4. Καθιστά το ενεργό κέντρο G-site του ενζύμου πολύ λιγότερο προσβάσιμο στο υπόστρωμα

Human Pyrophosphorylases (AGX)

Human Pyrophosphorylases (AGX) Συμμετέχουν στη γλυκοζυλίωση πρωτεϊνών Πιο συγκεκριμένα θα δούμε τις διαφορές μεταξύ AGX1 και AGX2 Η AGX2 συγκριτικά με την AGX1 περιέχει 17 επιπλέον αμινοξέα λόγω εναλλακτικού ματίσματος

AGX1 VS AGX2 H AGX1 είναι διμερές ενώ η AGX2 μονομερές Λόγω αλλαγής στην αρχιτεκτονική του ενεργού κέντρου, αναγνωρίζουν διαφορετικά υποστρώματα. Οι δύο αυτές πρωτείνες είναι διαφορετικά κατανεμημένες στο ανθρώπινο σώμα (η AGX1 εκφράζεται σε μεγάλο βαθμό στους όρχεις, ενώ η AGX2 όχι)

Αποτέλεσμα Το παράδειγμα των AGX1 και AGX2 υποδηλώνει τη σημασία του εναλλακτικού ματίσματος για τη διαφοροποίηση των πρωτεϊνών σε διαφορετικούς ιστούς.

Wilms’ tumor-suppresor protein

Wilms’ tumor-supressor protein (WT1) Μεταγραφικός παράγοντας Αλλαγές στο γονίδιο της WT1 δύνανται να προκαλέσουν όγκους σε παιδιά και ανωμαλίες στο ουρογεννητικό σύστημα Στο καρβοξυτελικό άκρο της αποτελείται από 4 περιοχές με δυνατότητα για σύνδεση με DNA

WT1 + KTS το αποτέλεσμα του εναλλακτικού ματίσματος Προσθήκη του τριπεπτιδίου Lys-Thr-Ser (KTS) μεταξύ των δυο τελευταίων περιοχών στο καρβοξυτελικό άκρο Άμεση συνέπεια η αλλαγή στη δυνατότητα της πρωτεΐνης να προσδένεται στο DNA και η διαφορετική εντόπισή της στον πυρήνα του κυττάρου

Πιο συγκεκριμένα… Η WT1-KTS εντοπίζεται κυρίως κοντά στα σωμάτια ματίσματος και στα coiled bodies, ενώ η WT1 κατά κύριο λόγο σε περιοχές του πυρήνα πλούσιες σε DNA Δομικά βέβαια, οι δύο πρωτεΐνες είναι σχεδόν πανομοιότυπες όταν δε συνδέονται με το DNA

Πιο συγκεκριμένα… Ωστόσο η διαφορά τους γίνεται αισθητή κατά τη σύνδεσή τους με το DNA Το τριπεπτίδιο KTS προσδίδει ευκαμψία στο συνδέτη των δυο τελευταιων περιοχων Έτσι η πρόσδεση της WT1-KTS στο DNA δεν είναι τόσο ισχυρή όσο της WT1

Το αποτέλεσμα Χάρη στα εξής 2 δεδομένα: Η WT1-KTS εντοπίζεται κοντά στα συστατικά της <<μηχανής ματίσματος>> (RNA και πρωτεΐνες) Με τη χρήση ολόκληρων γενομικών βιβλιοθηκών δεν ανιχνεύθηκε καμία σύνδεση μεταξύ του συγκεκριμένου ενζύμου και του DNA. Αποδείχθηκε ότι λειτουργεί μέσω RNA σύνδεσης!

Εν κατακλείδι Στο συγκεκριμένο παράδειγμα μέσω του εναλλακτικού ματίσματος το κύτταρο ελέγχει τις πρωτεονουκλεϊκές αλληλεπιδράσεις καθώς και την περίσσεια των δύο πρωτεϊνών στον πυρήνα

Εναλλακτικό μάτισμα στο Νευρικό Σύστημα

Νευρικός ιστός… πολύπλοκος και δαιδαλώδης Αποτελεί τη βάση για τη συμπεριφορά μας, την πνευματική λειτουργία και όχι μόνο… Στον εγκέφαλο παρατηρείται η μεγαλύτερη μεταγραφική λειτουργία σε σχέση με τα υπόλοιπα όργανα Η ποικιλία πρωτεϊνών που εντοπίζεται στο νευρικό ιστό δεν οφείλεται μόνο στην πληθώρα γονιδίων που εκφράζονται, αλλά και στο εναλλακτικό μάτισμα !

Ας δούμε μερικά παραδείγματα…

Picollo

Piccolo Πρωτεΐνη που εντοπίζεται στις προσυναπτικές ενεργές ζώνες των νευρώνων Παίζει σημαντικό ρόλο στην εξαρτώμενη από Ca2+ απελευθέρωση νευροδιαβιβαστή Στο καρβοξυτελικό (C) άκρο διαθέτει δύο περιοχές (C2A και C2B) οι οποίες υπόκεινται σε εναλλακτικό μάτισμα

Χαρακτηριστικά των C2 τομέων Πρόσδεση σε ιόντα ασβεστίου δίχως μεταβολή της δομής τους Σύνδεση τριών Ca2+ σε μικρή περιοχή στις ανώτερες θηλιές

Μετά το εναλλακτικό μάτισμα όμως… Ο C2A τομέας της Picollo, με την προσθήκη 9 αμινοξέων παρουσιάζει χαμηλή συγγένεια προς τα ιόντα Ca2+ Η προσθήκη έχει συμβεί στην περιοχή των θηλιών με αποτέλεσμα τη δημιουργία δομής ασύμβατης προς τα Ca2+

Αποτέλεσμα Ωστόσο, έχει προταθεί ένα μοντέλο σύμφωνα με το οποίο η C2A ύστερα από το μάτισμα δύναται να προσδεθεί σε Ca2+ χάρη σε ανακατανομή δευτερευόντων δομικών στοιχείων Το γεγονός αυτό προσδίδει στην Picollo τη δυνατότητα να ανταπεξέρχεται στην αρχική της ιδιότητα ακόμη και όταν συντελούνται ανακατανομές φωσφολιπιδίων ή δεσμευμένων πρωτεϊνών στην κυτταροπλασματική μεμβράνη.

Agrin

Agrin-Ιδιότητες Πρωτεογλυκάνη Εντοπίζεται κατά κύριο λόγο στις νευρομυϊκές συνάψεις στις μετασυναπτικές μεμβράνες Υπεύθυνη για τη συσσώρευυση υποδοχέων ακετυλοχολίνης (Ach) στις μετασυναπτικές μεμβράνες των μυϊκών κυττάρων

Εναλλακτικό μάτισμα στην αμινοτελική περιοχή Η αμινοτελική περιοχή της Agrin δίχως εναλλακτικό μάτισμα προσδένεται σε συγκεκριμένους τομείς των λαμινίνων (εντοπίζεται σε μη νευρικά κύτταρα και σε κινητικούς νευρώνες) Ύστερα όμως, από την παραπάνω διαδικασία η agrin δύναται να αποτελέσει διαμεμβρανική πρωτεΐνη (εντοπίζεται σε νευρώνες του εγκεφάλου)

Εναλλακτικό μάτισμα στην καρβοξυτελική περιοχή Οι περιοχές G2 και G3 της καρβοξυτελικής περιοχής της Agrin υπόκεινται σε εναλλακτικό μάτισμα

Εναλλακτικό μάτισμα στην G2 περιοχή Προσθήκη 4 αμινοξέων Κωδικοποιεί θέση πρόσδεσης ηπαρίνης Η προσθήκη αυτή κωδικοποιείται σε νευρικά και νευρογλοιακά κύτταρα

Εναλλακτικό μάτισμα στην G3 περιοχή Προσθήκη 8, 11 ή 19 αμινοξέων Σημαντικές για σχηματισμό λειτουργικών νευρωμυϊκών συνάψεων και συσσώρευση υποδοχέων Ach in vitro

Αποτέλεσμα Το εναλλακτικό μάτισμα στην περίπτωση της Agrin παράγει άλλες μορφές της, οι οποίες χρησιμεύουν σε ποικίλους κυτταρικούς τύπους Ωστόσο, ορισμένες μορφές που παράγονται αποτελούν αίτιο πολλών ασθενειών, όπως μυϊκή δυστροφία λόγω εναλλακτικού ματίσματος στους τομείς G2 και G3

Ολοκληρώνοντας… Το εναλλακτικό μάτισμα αποτελεί καθοριστικό παράγοντα ποικιλομορφίας και πολυπλοκότητας των οργανισμών Ακόμη και η προσθήκη μερικών αμινοξέων μπορεί να προκαλέσει σημαντικές μεταβολές στη δομή και τη λειτουργία των πρωτεϊνών Άλλοτε εξυπηρετεί σε άλλες ανάγκες του κυττάρου και άλλοτε καταστροφικά για αυτό

Πηγές Tibs, Vol. 30, September 2005

Σας ευχαριστώ για την προσοχή σας