ΜΕΡΟΣ I: ΔΟΜΗ ΜΕΜΒΡΑΝΩΝ Πρωτεΐνες και Λιπίδια Μεμβρανών Φυσιολογία Μεμβρανών 2009 ΜΕΡΟΣ I: ΔΟΜΗ ΜΕΜΒΡΑΝΩΝ Πρωτεΐνες και Λιπίδια Μεμβρανών Ε. Κωλέττας Μονάδα Κυτταρικής και Μοριακής Φυσιολογίας Εργαστήριο Φυσιολογίας Ιατρική Σχολή Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων

ΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΜΕΜΒΡΑΝΕΣ ΕΧΟΥΝ ΠΟΛΛΑΠΛΟΥΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΟΥΣ ΡΟΛΟΥΣ Λειτουργούν ως φραγμοί διαχωρίζοντας το κύτταρο από το περιβάλλον Δημιουργούν ενδοκυτταρικά διαμερίσματα Εμπλέκονται στη είσοδο θρεπτικών συστατικών και στην εκροή βιοσυνθετικών προϊόντων Εμπλέκονται ως διαμεσολαβητές στην κυτταρική επικοινωνία και ορίζουν την ταυτότητα του κυττάρου Λαμβάνουν και μεταδίδουν διάφορα σήματα/μηνύματα (signals)

Κύρια Συστατικά Κυτταρικών Μεμβρανών: Λιπίδια Πρωτεΐνες Υδατάνθρακες Κύρια Συστατικά Κυτταρικών Μεμβρανών: Λιπίδια Πρωτεΐνες Υδατάνθρακες Διαφορετικές μεμβράνες έχουν διαφορετική αναλογία πρωτεΐνης/λιπιδίων (3.6 για μιτοχόνδρια, 1.1 για πλασματική μεμβράνη, 0.25 για μυελίνη). Αυτή η ιδιότητα μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την απομόνωση διαφορετικών μεμβρανών. Ο τύπος της μεμβράνης μπορεί να ταυτοποιηθεί από την παρουσία ειδικών πρωτεϊνικών μαρτύρων. Για παράδειγμα: ATPάση Na/K-είναι μάρτυρας της πλασματικής μεμβράνης, ενώ η αφυδρογονάση του σουκινικού (succinate dehydrogenase) είναι μιτοχονδριακός μάρτυρας.

Στις κυτταρικές μεμβράνες υπάρχει διαχωρισμός των λειτουργιών των δύο κύριων συστατικών: Λιπιδίων και Πρωτεϊνών ● Τα λιπίδια είναι υπεύθυνα για τη διαμερισματοποίηση των κυτταρικών μεταβολιτών. ● Οι πρωτεΐνες εμπλέκονται στις περισσότερες βιοχημικές αντιδράσεις που διεξάγονται στο κύτταρο.

Σύσταση Λιπιδίων στις Κυτταρικές μεμβράνες Φωσφολιπίδια (τα κύρια λιπίδια, αποτελούν το, 50-90% των ολικών λιπιδίων των μεμβρανών Τα περισσότερα φωσφολιπίδια είναι παράγωγα της 3-φωσφ-διακυλο γλυκερόλης ή φωσφατιδικού (diacyl-glycerol-3-phosphate, phosphatide) Στερόλες (5-25% του περιεχομένου των μεμβρανών, οι στερόλες είναι ασυνήθιστα πιο συγκεντρωμένες στην πλασματική μεμβράνη) Γλυκολιπίδια (τα λιγότερο άφθονα, συνήθως απαντώνται σε λιγότερο από 5%)

Δομή ενός μορίου Φωσφολιπιδίου Στα ευκαρυωτικά τα δύο μεταβλητά ακυλο- κατάλοιπα (C14 to C24) παράγονται από μη-διακλαδισμένα λιπαρά οξέα, για παράδειγμα: Κορεσμένα λιπαρά οξέα (Saturated FA) C16 (16:0) Παλμιτικό οξύ CH3-(CH2)14-COOH Ακόρεστα λιπαρά οξέα (Unsaturated FA) C18 (18:1) Ολεικό οξύ CH3-(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-COOH

H C=C CH2 Κορεσμένες και Ακόρεστοι Άλυσοι των Ακυλο λιπαρών οξέων έχουν διαφορετικά σχήματα Διπλοί δεσμοί βρίσκονται συνήθως στη διαμόρφωση cis. Αυτό οδηγεί στο στρέβλωμα της ακυλο-αλυσίδας. C=C H CH2

Κύρια Φωσφολιπίδια στις Κυτταρικές μεμβράνες των Θηλαστικών Τα φωσφολιπίδια παράγονται με την εστεροποίηση της φωσφορικής ομάδας του φωσφατιδίου με ένα υδροξύλιο μιας από αρκετές αμινοαλκοόλες O || R1 – C – O – C H2 | R2 – C – O – CH O || | || O H2C - O - P – O - O – Φωαφατιδικό η φωσφο-διακυλογλυκερόλη είναι το ενδιάμεσο της βιοσύνθεσης πολλών φωσφολιπιδίων Τυπικές Αμινοαλκοόλες: Χολίνη OH-CH2-CH2-N+(CH3)3 Αιθανολαμίνη OH-CH2-CH2-NH+3 Σερίνη OH-CH2-CH – COO- | NH+3 Γλυκερόλη OH-CH2-CH–CH2-OH | OH Ινοσιτόλη

Σφιγγοσίνη Σφιγγομυελίνη

Το απλούστερο γλυκολιπίδιο είναι το κερεβροσίδιο (cerebroside), που περιέχει ένα κατάλοιπο σακχάρου (γαλακτόζης). Τα Γαγκλιοσίδια (Gangliosides) περιέχει μια διακλαδισμένη αλυσίδα πε έως και 7 κατάλοιπα σακχάρου.

Χολικά οξέα (Bile acids) [Χολικά άλατα (Bile salts)] είναι πολικά παράγωγα της χοληστερόλης. Σχηματίζονται στο ήπαρ από τη χοληστερόλη, και εκκρίνονται στη χοληδόχο κύστη. Τα χολικά οξέα εισέρχονται διαμέσου του χοληφόρου πόρου στο έντερο, όπου διευκολύνουν την πέψη των λιπών και των λιποδιαλυτών βιταμινών που προέρχονται από τη διατροφή.

Σχηματισμός και Ιδιότητες της Διπλοστιβάδας Λιπιδίων (Lipid Bilayer)

Τα φωσφολιπίδια είναι αμφιπαθή μόρια και οι αμφιπαθείς ιδιότητες τους είναι απαραίτητες για τον αυθόρμητο σχηματισμό της διπλοστιβάδας λιπιδίων Διπλοστιβάδα Λιπιδίων Διπλοστιβάδα Λιπιδίων Γιατί τα λιιπίδια σχηματίζουν μια διπλοστιβάδα και όχι ένα μικκύλιο; Δύο ακυλο λιπαρές άλυσοι (fatty acyl chains) είναι ογκώδεις για να προσαρμοστούν στο εσωτερικό ενός μικυλλίου

Σημαντικά χαρακτηριστικά των διπλοστιβάδων λιπιδίων : Αυτό-συγκρότηση η οποία ωθείται από υδρόφοβες επιδράσεις Σφικτό/Ισχυρό πακετάρισμα Ικανότητα σύντηξης και επιμήκυνσης (αυτή η ιδιότητα αποτελεί τη βάση της εξωκύττωσης και της ενδοκύττωσης, της σύντηξης μεταξύ ωαρίων και σπερματοζωαρίων, και της κυτταρικής διαίρεσης)

Χρήση απορρυπαντικών για τη are used to αποσυγκρότηση της δομής της διπλοστιβάδας λιπιδίων και για την απομόνωση μεμβρανικών πρωτεϊνών

Η Διπλοστιβάδα λιπιδίων είναι ασύμμετρη Τα λιπίδια συνθέτονται στο ενδοπλασματικό δίκτυο (ER), από όπου μεταφέρονται με τη βοήθεια κυστιδίων προς την πλασματική μεμβράνη ή τις μεμβράνες άλλων κυτταρικών οργανιδίων όπου συντήσσονται με αυτές. Κατά τη σύνθεση, τα λιπίδια διαχωρίζονται σε συγκεκριμένη στιβάδα στο ER

Τα σάκχαρα των γλυκολιπιδίων τροποποιούνται μόνον στο εσωτερικό της συσκευής Golgi όπου υπάρχουν τα απαραίτητα ένζυμα Ο προσανατολισμός των δύο στιβάδων διατηρείται κατά τη σύντηξη με τη μεμβράνη-στόχο ΣΥΝΕΠΩΣ, οι δύο στιβάδες της λιπιδικής διπλοστιβάδας έχουν διαφορετική σύσταση (Άρα η διπλοστιβάδα είναι ασύμμετρη) Το % των διαφορετικών κατηγοριών φωσφο-, γλυκο- και σφιγγο-λιπιδίων διαφέρει στις δύο στιβάδες λιπιδίων (η χοληστερόλη απαντάται περίπου στο ίδιο % και στις δύο στιβάδες)

Οι Μεμβράνες έχουν ρευστή δομή http://www.biochem.arizona.edu/classes/bioc462/462a/NOTES/LIPIDS/diff.html

Η ρευστότητα των μεμβρανών είναι σημαντική Η ρευστότητα των μεμβρανών είναι σημαντική για: Σύντηξη των μεμβρανών, δηλ. τη σύντηξη των κυστιδίων με τα οργανίδια Πλευρική διάχυση (μετακίνηση) νέων λιπιδίων και νέων πρωτεϊνών, έτσι ώστε να έχουν ισοδύναμη κατανομή Πλευρική διάχυση πρωτεϊνών και άλλων μορίων κατά μήκος της μεμβράνης κατά την ενεργοποίηση πορειών μεταγωγής σήματος Κατάλληλος διαχωρισμός μεμβρανών κατά την κυτταρική διαίρεση

Πλευρική μετακίνηση (Πλευρική διάχυση) Η κινητικότητα των λιπιδίων είναι ~ 2 mm/sec Η κινητικότητα των πρωτεϊνών είναι ~10-4 με 0.4 mm/sec Περιστροφή κατά μήκος της λιπιδικής διπλοστιβάδας (Εγκάρσια διάχυση, flip-flop) Ένα μόριο φωσφολιπιδίου περιστρέφεται εγκάρσια (flip-flop) μια φορά μέσα σε αρκετές ώρες Οι πρωτεΐνες δεν περιστρέφονται

Η ρευστότητα της μεμβράνης εξαρτάται από τη σύσταση των λιπιδίων Το άκαμπτο σύστημα δακτυλίων της χοληστερόλης παρεμβάλλεται στο σφικτό πακετάρισμα των αλυσίδων των λιπαρών οξέων των φωσφολιπιδίων και έτσι αναστέλλει τη μετάβαση από την ‘υγρή κρυσταλλική’ κατάσταση στην ‘κρυσταλλική’ κατάσταση με τη μείωση της θερμοκρασίας. Συγχρόνως, η άκαμπτη χοληστερόλη μειώνει τη ρευστότητα της μεμβράνης. Παράγοντες που επηρεάζουν τη ρευστότητα των μεμβρανών : ● Μήκος των άκυλο-αλύσων των λιπιδίων ● Βαθμός της ακορεστότητας των άκυλο- αλύσων των λιπιδίων ● Παρουσία χοληστερόλης

Μεμβρανικές πρωτεΐνες και η αλληλεπίδραση τους με τη διπλοστιβάδα λιπιδίων Ενσωματωμένες (Διαμεμβρανικές) μεμβρανικές πρωτεΐνες (Integral or Transmembrane Proteins): Εκτείνονται μέσα στη μεμβράνη μια ή περισσότερες φορές και μπορούν να απομονωθούν μόνο με τη χρήση απορρυπαντικών. Περιφερειακές πρωτεΐνες (Peripheral proteins) συνδέονται είτε ομοιοπολικά με τα λιπίδια ή αλληλεπιδρούν ισχυρά με διαμεμβρανικές πρωτεΐνες. Αυτές οι πρωτεΐνες μπορούν να απομονωθούν από τις μεμβράνες είτε με την επεξεργασία τους με ένζυμα ή με τη χρήση ορισμένων αντιδραστηρίων που δεν καταστρέφουν την ακεραιότητα της μεμβράνης.

Η α-έλικα είναι το κύριο δομικό στοιχείο των διαμεμβρανικών πρωτεϊνών (membrane-bound proteins)

Παραδείγματα Διαμεμβρανικών Πρωτεϊνών (Ca2+-transporting ATPase) ATPάση μεταφοράς Ca2+ (Ca2+-transporting ATPase) Δίαυλος K+ (K+-channel)

β-Πτυχωτή (β-barrel)

Όλες αυτές οι τοξίνες παίζουν σημαντικό ρόλο στη βακτηριακή παθογένεση Τοξίνες που σχηματίζουν Πόρους (Pore-forming toxins): [α-Αιμολυσίνη (α-hemolysin), Αερολυσίνη (aerolysin), Προστατευτικό αντιγόνο άνθρακα (anthrax protective antigen), α-Τοξίνη Κλοστριδίου (Clostridium septicum α-toxin)] Όλες αυτές οι τοξίνες παίζουν σημαντικό ρόλο στη βακτηριακή παθογένεση α-Αιμολυσίνη: Υδατοδιαλυτή πρωτεΐνη ΜΒ 33.2 kDa που εκκρίνεται από το Staphylococcus aureus Προσδένει στα κύτταρα του αίματος και σχηματίζει μια πεντα΄μερή δομή ΜΒ 232.4 kDa 100x100 Å Ο πόρος που περιέχει νερό έχει διάμετρο ~14Å. Ιόντα, H2O και μικρά μόρια (ΜΒ < 2 kDa) είναι διαπερατά και προκαλούν κυτταρικό θάνατο. Η α-αιμολυσίνη δεν έχει υδρόφοβες αλληλουχίες στη μονομερή δομή της και αντιπροσωπεύει την οικογένεια των διαύλων με β-πτυχωτές

Δομή Μεμβράνης: Το Ρευστό Μωσαϊκό Μοντέλο Δομή Μεμβράνης: Το Ρευστό Μωσαϊκό Μοντέλο Το μοντέλο προτάθηκε από τους Jonathan Singer και Garth Nicolson το 1972 Τα κύρια χαρακτηριστικά του μοντέλου είναι : Οι μεμβράνες είναι ρευστές δομές δύο διαστάσεων προσανατολισμένων λιπιδίων και πρωτεϊνών Η λιπιδική διπλοστιβάδα έχει διττό ρόλο: Σχηματίζει ένα φραγμό διαπερατότητας (permeability barrier) και αλληλεπιδρά με πρωτεΐνες διατηρώντας αυτές τις πρωτεΐνες διαλυτές και ρυθμίζοντας την ενεργότητα τους Οι μεμβρανικές πρωτεΐνες υφίστανται ελεύθερη πλευρική διάχυση, αλλά δεν περιστρέφονται από τη μια πλευρά της μεμβράνης στην άλλη πλευρά της