Ahmed Saqfalhait 4967

 Σχεδόν όλες οι πτυχές της ανθρώπινης καθημερινής συμπεριφοράς και της φυσιολογίας κυβερνώνται από ένα κύριο ρολόι στον υπερχιασματικό πυρήνα (SCN) του υποθαλάμου. Αυτός ο εγγενής ταλαντωτής όχι μόνο κυβερνά το συγχρονισμό ύπνου και ιχνών, αλλά και τους ρυθμούς της θερμοκρασίας, των ορμονών μελατονίνης και κορτιζόλης, της διάθεσης και της γνωστικής οξύτητας, της καρδιακής, αναπνευστικής, και νεφρικής λειτουργίας, και των περισσότερων πτυχών της πέψης και της αποτοξίνωσης.

 Αυτοί οι ρυθμοί παρασύρονται σε 24 ώρες από τον περιβαλλοντικό φως-σκοτάδι κύκλο πρώτιστα μέσω ενός υποσυνόλου των φωτοευαίσθητων αμφιβληστροειδικών γαγγλιακών κυττάρων που προβάλλουν άμεσα στον SCN. Χρησιμοποιώντας πολλαπλά ορμονικά και νευρωνικά σήματα, το ''κύριο'' ρολόι του SCN παρασύρει στη συνέχεια περιφερικά ρολόγια παρόμοιου μοριακού μηχανισμού που είναι παρόντα στα περισσότερα κύτταρα του σώματος.

 Οι μεταλλαγές στα γονίδια του ρολογιού έχουν επιπτώσεις στο μήκος περιόδου, και μπορεί να οδηγήσουν σε αναταραχές ύπνου κιρκαδικού ρυθμού όπως το Προηγμένο σύνδρομο φάσης ύπνου (ASPS). Η μέτρηση της κιρκαδικής περιόδου είναι επομένως ένα χρήσιμο βήμα να αξιολογήσει την κιρκαδική λειτουργία κιρκαδικού ρολογιού, είτε πειραματικά είτε κλινικά.

 Είναι μια ορμόνη που παράγεται από τον κωνοειδή αδένα με έναν σαφή κιρκαδικό ρυθμό σε χαμηλά επίπεδα την ημέρα και μια αιχμή κατά τη διάρκεια της νύχτας στα κανονικά παρασυρμένα άτομα. Ο συγχρονισμός της συλλογής δειγμάτων είναι επομένως κρίσιμος για τη μέτρηση. Τα επίπεδα της Μελατονίνης αξιολογούνται πρώτιστα για να καθορίσει το συγχρονισμό του εσωτερικού ρολογιού σώματος ενός ατόμου και επομένως να δείξει οποιαδήποτε μη ευθυγράμμιση στην εικοσιτετράωρη μέρα.

 Για αυτήν την μελέτη, βλέποντα και τυφλά άτομα έχουν μισθωθεί σε τρεις χώρες (στην Ελβετία, στην Ρωσία και στο Ηνωμένο Βασίλειο).

 τα βλέποντα άτομα απαιτήθηκαν για να εμμείνουν σε ένα κανονικό πρόγραμμα ύπνου-ίχνης για 5–14 ημέρες πριν από την αποδοχή στο εργαστήριο. Στη συνέχεια, τα άτομα διατηρήθηκαν υπο διάφορα σύνολα "σταθερών " όρων με σκοπό να αποβάλουν τις περιβαλλοντικές επιρροές επάνω στον κιρκαδικό ταλαντωτή. Τα δείγματα σαλίου συλλέχθηκαν σε διαστήματα 0,3 –3 ωρών και αναλύθηκαν για το περιεχόμενο Μελατονίνης μέσω direct double- antibody radioimmunoassay

 Η Radioimmunoassay επιτρέπει την ανίχνευση των μικρών συγκεντρώσεων των βιολογικών (ορμονών) ή φαρμακολογικών ουσιών στο αίμα ή άλλα ρευστά δείγματα (στο πείραμά μας είναι το σάλιο) χρησιμοποιώντας τις αντιδράσεις αντιγόνων / αντισωμάτων. Η τελική ανάλυση ολοκληρώνεται μέσω της ποσολόγησης των συνδεδεμένων ραδιενεργών αριθμήσεων με έναν μετρητή γάμμα Packard που συνδέεται με έναν αυτοματοποιημένο σταθμό μείωσης στοιχείων.

 Τα τυφλά άτομα ( όλα χωρίς την αντίληψη για το φως, Guildford ), μελετήθηκαν στα σπίτια τους για 3 –5 διαδοχικές εβδομάδες.  Για 48 ώρες κάθε εβδομάδα, τα άτομα συνέλεξαν διαδοχικώς ένα δείγμα ούρων κάθε 4 ώρες κατά τη διάρκεια της ημέρας συν ένα ολονύκτιο δείγμα.  Οι ουρικές συγκεντρώσεις της 6sulphatoxymelatonin (aMT6s) (ένας δείκτης της συγκέντρωσης μελατονίνης στο αίμα) μετρήθηκαν από radioimmunoassay. acrophase  Ουρικά στοιχεία από κάθε 48-ώρες αξιολόγηση υποβλήθηκαν στην ανάλυση cosinor (λογισμικό παρεχόμενο από τον Dr. D. S. Minors, University of Manchester, UK) για να καθορίσει το acrophase (Ο χρόνος στον οποίο η αιχμή ενός ρυθμού εμφανίζεται ), ή τον εγκατεστημένο μέγιστο χρόνο του ρυθμού της aMT6s.

 Τα μήκη περιόδου καθορίστηκαν από το συγχρονισμό των διαστημάτων μεταξύ της ανόδου μελατονίνης, είτε από την ανάλυση οπισθοδρόμησης, είτε από την ανάλυση λογισμικού Cosinor TM (SEPTMR)

 Γιατί στους ινοβλάστες;  Γιατί η κυτταρική απεικόνιση της έκφρασης γονιδίων έχει αποκαλύψει ότι οι ινοβλάστεις περιέχουν έναν γερό, αυτόνομο και κύτταρο-αυτόνομο κιρκαδικό ταλαντωτή, με μια σειρά των ιδιοτήτων που και επικαλύπτεται και αντιπαραθέτει με εκείνους του νευρικού ρολογιού του SCN.

Bmal1-luciferase lentivirus.  Δύο κυλινδρικές δερματικές βιοψίες διαμέτρων 2mm λήφθηκαν από τους γλουτούς ή απο τις βραχίονες κάθε ατόμου. Οι ινοβλάστεις απομονώθηκαν από τις βιοψίες και μολύνθηκαν χρησιμοποιώντας Bmal1-luciferase lentivirus.

 Bmal1:  Bmal1: είναι αυτό το γονίδιο που κωδικοποιεί τις πρωτεϊνες που ρυθμίζουν τον κιρκαδικό ρυθμό. Σχηματίζει ένα ετεροδιμερές με το CLOCK (ένα άλλο γονίδιο). Αυτό το συγκρότημα δεσμεύει ένα E-box προς τα πάνω του γονιδίου PER1, ενεργοποιώντας αυτό το γονίδιο και ενδεχομένως άλλα κιρκαδικά ρυθμός- συνδεμένα γονίδια.  luciferase lentivirus:  luciferase lentivirus: σημειώνοντας τα κύτταρα με ένα γενετικά κωδικοποιημένο δημοσιογράφο γονίδιο. Τα διανύσματα Lentiviral είναι βασισμένα στο HIV-1.

πώς λειτουργεί; Επάνω σε ιογενή μεταγωγή, τα κύτταρα ξενιστή εκτίθενται σε ιογενό RNA και εκτελούνται ιογενά ένζυμα (εδώ είναι το Luciferase ). Το ιογενό RNA είναι αντίστροφο- μεταγραφόμενο σε DNA, και ένα επόμενος προ- ολοκληρωμένος σύνθετος εισάγεται ενεργά στον πυρήνα, και σταθερά ενσωματώνεται στο γονιδίωμα ξενιστή. Μια ή δύο ημέρες κατόπιν, το lentiviral γονιδίωμα είναι ενσωματωμένο στο γονιδίωμα ξενιστή.

Το θετικό άκρο των θηλαστικών μηχανημάτων ρολογιών αποτελείται από το CLOCK και το BMAL1, τα οποία είναι παράγοντες μεταγραφής που heterodimerize (σχηματισμός ενός δεμερούς απο δύο διαφοερτικά μονομερή) και επάγουν την έκφραση των ρολογι - ελεγχόμενων γονιδιών με τη δέσμευσή τους στους υποστηρικτές E-boxes. Τα Cryptochromes (Cry 1, Cry2) και τα γονίδια περιόδου (Per1, Per2, Per3) είναι ρολόι-ελεγχόμενα γονίδια που κωδικοποιούν τις πρωτεϊ'νες που διαμορφώνουν το αρνητικό άκρο των κιρκαδικών μηχανημάτων. Οι PER και CRY πρωτεϊ'νες θεωρούνται κλασικά για να μεταφέρονται στον πυρήνα για να εμποδίσουν την CLOCK:BMAL1 μεσολαβημένη μεταγραφή, με αυτόν τον τρόπο κλείνει το αρνητικό σύστημα ανατροφοδότησης πληροφοριών.

 Πέντε ημέρες ή περισσότερα μετά από την μόλυνση ανθρώπινων ινοβλάστεων, οι κιρκαδικοί ρυθμοί συγχρονίστηκαν από 100 nM dexamethasone, και το προϊόν φως μετρήθηκε (3 μετρήσεις ανά βιοψία σύνολο 6 μετρήσεων ανά άτομο ). Ο προσδιορισμός περιόδου ολοκληρώθηκε με το CosinorTM λογισμικό (SEPTMR) ανάλυση των στοιχείων μεταξύ της δεύτερης και της πέμπτης ημέρας της μέτρησης.

 Η φυσιολογική περίοδος καθορίστηκε από το συγχρονισμό της μελατονίνης  Τα επίπεδα της μελατονίνης αξιολογούνται πρώτιστα για να καθορίσουν το συγχρονισμό εσωτερικού ρολογιού σώματος ενός ατόμου και επομένως για να δείξουν οποιαδήποτε μη ευθυγράμμιση στην εικοσιτετράωρη ημέρα.  Από κάθε άτομο, δύο βιοψίες δέρματος λήφθηκαν, και οι ινοβλάστεις καλλιεργήθηκαν από αυτές. Το κιρκαδικό μήκος περιόδου αυτών των ινοβλάστεων μετρήθηκε έπειτα μέσω μεταγωγής ενός lentiviral κιρκαδικού δημοσιογράφου και επόμενου μακροπρόθεσμου βιοφωτοβόλου έλεγχου.

A. Παρουσιάζονται τα στοιχεία από ένα αντιπροσωπευτικό άτομο. Ανοικτοί κύκλοι είανι οι τιμές μέτρησης της μελατονίνης. B. Από το ίδιο άτομο, οι καλλιέργιες ινοβλάστεων λήφθηκαν από δύο χωριστές βιοψίες και μολύνθηκαν με έναν lentiviral βιοφωτοβόλο κιρκαδικό δημοσιογράφο. Μετά από το συγχρονισμό με dexamethasone, οι κιρκαδικές ταλαντώσεις στη βιολογική ακτινοβολία καταγράφηκαν από οκτώ μετρήσεις κατά την διάρκεια πέντε ημερών. Τρεις κύκλοι αυτής της ταλάντωσης παρουσιάζονται ευθυγραμμισμένες με τα φυσιολογικά στοιχεία του μέρους A.

 Για όλα τα άτομα, οι εκτιμήσεις της φυσιολογικής περιόδου in vivo συγκρίθηκαν με την περίοδο ινοβλάστεων.  Σε όλες τις ομάδες, οι θετικοί συσχετισμοί παρατηρήθηκαν μεταξύ της περιόδου ινοβλάστεων και της φυσιολογικής περιόδου που μετρήθηκαν στα ίδια άτομα. Μήκη περιόδου που λήφθηκαν από τα άτομα από τις φυσιολογικές μετρήσεις και από τις μοριακές αναλύσεις ινοβλάστεων.

Με άλλα λόγια, οι κυτταρικές περίοδοι ινοβλάστεων ήταν παρόμοιες μεταξύ των ομάδων ατόμων ακόμα κι αν οι φυσιολογικές περίοδοι ποίκιλαν.  Τα μέσα φυσιολογικά μήκη περιόδου ήταν σημαντικά πιό μακροχρόνια για τα τυφλά άτομα απ'ό,τι για τα βλέποντα άτομα. Εκπληκτικά, η μέση περίοδος ινοβλάστεων ήταν η ίδια για αυτούς τους τρεις πληθυσμούς όταν μετριέται υπό τους ίδιους όρους. Με άλλα λόγια, οι κυτταρικές περίοδοι ινοβλάστεων ήταν παρόμοιες μεταξύ των ομάδων ατόμων ακόμα κι αν οι φυσιολογικές περίοδοι ποίκιλαν. Επομένως, οι μετρήσεις ινοβλάστεων που πέτυχαν στη σύλληψη των διατομικών διαφορών στην περίοδο μεταξύ των μελών κάθε ομάδας (εάν ήταν τυφλά ή βλέποντα ), αλλά ήταν αναίσθητες στις προφανείς διαφορές μεταξύ των τυφλών και βλέποντων ατόμων.

A. A. Οι μέσοι όροι των μηκών περιόδου in vivo που λήφθηκαν με τα βλέποντα άτομα ήταν σημαντικά διαφορετικοί από αυτούς των τυφλών ατομών. B. B. Εντούτοις, οι ινοβλάστη- παραγόμενες τιμές δεν ήταν σημαντικά διαφορετικές και μεταξύ των τριών πληθυσμών. Relationship between population averages of human physiological period length and fibroblast period length.

 Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η περίοδος της ανθρώπινης κιρκαδικής συμπεριφοράς οδηγείται συνήθως από τις κυτταρικές ιδιότητες ρολογιών στα κανονικά άτομα και μπορεί να προσεγγιστεί από τη μέτρηση στα περιφερικά κύτταρα όπως οι ινοβλάστεις. Βασισμένοα στις διαφορές μεταξύ των βλέποντων και τυφλών ατόμων, επίσης σκεπτόμαστε ότι η περίοδος μπορεί να τροποποιηθεί από τους παρατεταμένους ασυνήθιστους όρους όπως η συνολική ελαφριά στέρηση της τύφλωσης.

 Το κύριο άρθρο  Το κύριο άρθρο nal.pone   ssay/radio-endo.php  079X x/abstract;jsessionid=6DBB370C9A E94 6E5A9C316AF.d02t03  pone