ΤΜΗΜΑ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΜΗΧΑΝΙΚΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΜΗΧΑΝΙΚΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΑΣΚΗΣΗ ΚΕΦΑΛΑΙΟΥ 2 ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗ ΚΙΝΗΤΙΚΗ

Όταν ένας μικροοργανισμός βρεθεί σ’ ένα θρεπτικό υλικό κατάλληλο για την ανάπτυξή του: Ο μικροοργανισμός πολλαπλασιάζεται: αύξηση της κυτταρικής μάζας. βιοσύνθεση των κυτταρικών συστατικών Ο μικροοργανισμός παράλληλα, παράγει ορισμένες ενώσεις (μεταβολίτες), που συσσωρεύονται στο θρεπτικό μέσο. Οι ενώσεις αυτές, μετά το τέλος της καλλιέργειας μπορούν να απομονωθούν, να καθαρισθούν και να συμπυκνωθούν. ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗ ΔΡΑΣΤΗΡΙΟΤΗΤΑ

Μικροβιακή Δραστηριότητα: Η μικροβιακή δραστηριότητα μπορεί να μετρηθεί: με μέτρηση της αύξησης του αριθμού των κυττάρων με μέτρηση μιας παραμέτρου του μέσου ανάπτυξης που μεταβάλλεται.

Μελέτη της μικροβιακής δραστηριότητας μ.ο σε Βιοαντιδραστήρα Μελέτη της μικροβιακής δραστηριότητας μ.ο σε Βιοαντιδραστήρα Ανάπτυξη και πολλαπλασιασμός Παραγωγή μεταβολιτών Καθορισμός βέλτιστων συνθηκών

Βιοαντιδραστήρας

Μικροβιακή κινητική: μελέτη εξέλιξης μίας μικροβιακής καλλιέργειας Για την μελέτη της εξέλιξης μιας μικροβιακής καλλιέργειας πραγματοποιείται μια καλλιέργεια σε ένα κλειστό σύστημα ζύμωσης (batch) Επειτα από τον εμβολιασμό, παρακολουθείται η ανάπτυξη μέχρι την εξάντληση των θρεπτικών υλικών του υποστρώματος. Οι διάφοροι εξωτερικοί παράγοντες, και κυρίως η θερμοκρασία, διατηρούνται σταθεροί και ευνοϊκοί για τον προς μελέτη μικροοργανισμό.

Μικροβιακή κινητική: σχεδιασμός Καμπύλης ανάπτυξης

6 φάσεις στη καμπύλη ανάπτυξης: Φάση Προσαρμογής Φάση Εκκίνησης Εκθετική Φάση (ή Λογαριθμική, LOG phase) Φάση Επιβράδυνσης Φάση Στασιμότητας Φάση Θανάτου ΦΑΣΗ ΥΣΤΕΡΗΣΗΣ (LAG PHASE) ΦΑΣΗ ΣΤΑΣΙΜΟΤΗΤΑΣ

μ=ειδική ταχύτητα πολλαπλασιασμού Εκφράζει την αύξηση της βιομάζας (dx) στην μεταβολή του χρόνου (dt) ανά μονάδα βιομάζας (1/x) δηλαδή μ=(1/x)(dx/dt) Εκφράζεται σε h-1

μ Λογαριθμική φάση Χ2=αριθμός κυττάρων στον χρόνο t2 η τιμή μ λαμβάνει την μέγιστη τιμή της (μ = μ max), η τιμή του χρόνου διπλασιασμού td γίνεται ελαχίστη Ισχύει td=0,693/μ Ισχύει επίσης: μ LnX2-LnX1 t2-t1 Χ2=αριθμός κυττάρων στον χρόνο t2 X1=αριθμός κυττάρων στον χρόνο t1

Μικροοργανισμός Τº C μmax (h –1) Χρόνος διπλασιασμού (td) Aspergillus niger 30 0,20 3.46 Aspergillus nidulans 20 25 37 0,090 0,148 0,215 0,360 7,42 4,68 3,23 1,96

Παραγωγή μεταβολιτών

Μέθοδοι εκτίμησης ενός μικροβιακού πληθυσμού (και μελέτης της μικροβιακής εξέλιξης) Άμεσες μέθοδοι. Μέτρηση στο μικροσκόπιο Μέτρηση έπειτα από καλλιέργεια Ηλεκτρονική μέτρηση Προσδιορισμός του ξηρού βάρους Μέτρηση οπτικής πυκνότητας Έμμεσες μέθοδοι Μέτρηση προιόντων (μεταβολιτών) Μέτρηση υποστρώματος (πχ γλυκόζη)

Μέτρηση έπειτα από καλλιέργεια: Είναι η τεχνική που χρησιμοποιείται περισσότερο στη κλασσική μικροβιολογία τροφίμων παρά στη βιοτεχνολογία. Είναι μέθοδος ακριβείας διότι μετρώνται μόνο τα ζωντανά κύτταρα, αλλά έχει το μειονέκτημα ότι απαιτεί τουλάχιστον 24 ώρες για την εκτίμηση των αποτελεσμάτων.   Ηλεκτρονική μέτρηση: Εφαρμόζεται κυρίως σε εναιωρήματα ζυμών, με δυνατότητα τόσο της μέτρησης του αριθμού των κυττάρων όσο και του προσδιορισμού του μεγέθους τους.

Μέθοδοι για την εκτίμηση μικροβιακής ανάπτυξης σε βιοαντιδραστήρα: Πρέπει να δίνουν πληροφορίες σε σύντομο χρονικό διάστημα: Οπτική πυκνότητα Μικροσκόπιο Ξηρό βάρος Μέτρηση κατανάλωσης υποστρώματος

Μέτρηση στο μικροσκόπιο Η τεχνική αυτή παρουσιάζει αρκετά πλεονεκτήματα όπως η απλότητα και η ταχύτητα της μέτρηση. Συνίσταται στη χρησιμοποίηση ειδικών αντικειμενοφόρων πλακών (κυψελλίδες NEUBAUER) που έχουν μια χαραγή ορισμένου όγκου (συνήθως 0.1mm3) στην οποία προστίθεται το δείγμα. Η χαραγή αποτελείται από 25 μεγάλα τετράγωνα που το καθένα χωρίζεται σε 16 μικρότερα.

Μέτρηση στο μικροσκόπιο Μετρώντας τα κύτταρα στα μεγάλα τετράγωνα υπολογίζεται ο αριθμός των κυττάρων (ζυμών ή βακτηρίων ανά mL καλλιέργειας), σύμφωνα με το τύπο: Σ= 0,25x106xΝxΧ όπου: Σ : αριθμός κυττάρων / mL N : ο μέσος όρος κυττάρων σε 3 μεγάλα τετράγωνα Χ : η αραίωση του αρχικού δείγματος

Προσδιορισμός του ξηρού βάρους: Απομάκρυνση της βιομάζας, με φυγοκέντρηση ή διήθηση υπό κενό, από ένα ορισμένο όγκο του βιοαντιδραστήρα (π.χ.1L). Η βιομάζα συγκρατείται από ένα μεμβρανικό φίλτρο (μικροβιοκρατές, με διάμετρο πόρων 0,45μ) H βιομάζα στη συνέχεια ξηραίνεται μέχρι σταθερού βάρους και ζυγίζεται. Η μέθοδος αυτή δίνει αξιόπιστα αποτελέσματα, δεν μπορεί να γίνει όμως διάκριση μεταξύ νεκρής ή ζωντανής βιομάζας.

Μέτρηση οπτικής πυκνότητας: Στηρίζεται στο γεγονός ότι η οπτική πυκνότητα (OD=optical density) ενός διαλύματος είναι ανάλογη προς το συνολικό αριθμό των εναιωρούμενων σωματιδίων του . Μετράται σε φασματοφωτόμετρο η απορρόφηση του μικροβιακού εναιωρήματος στα 540 nm. Η οπτική πυκνότητα είναι ανάλογη του μικροβιακού φορτίου Είναι η πιο ταχεία μέθοδος, όμως και μ’ αυτή τη μέθοδο δεν μπορεί να γίνει διάκριση μεταξύ νεκρής και ζωντανής βιομάζας

Μέτρηση οπτικής πυκνότητας

Ποσοτικός προσδιορισμός γλυκόζης: (Μέθοδος KOLΤHOFF)   Σε κωνική φιάλη 250 mL βάζετε 25 mL από το διάλυμα, (πρέπει να περιέχει 0.05 - 0.08 g γλυκόζης) προστίθενται 20 mL ιώδιο 0.1Ν και 5 mL NaOH 0.5Ν. Η κωνική τίθεται στο σκοτάδι για 15 min. Στη συνέχεια το διάλυμα οξυνίζεται με 5mL H2SO4 5N και ογκομετρείται η περίσσεια του ιωδίου με Na2S2O3 0.1Ν προσθέτοντας 2-3 σταγόνες αμύλου. Παράλληλα εκτελείται λευκός προσδιορισμός με 25 mL νερού. Η διαφορά μεταξύ των δύο ογκομετρήσεων αντιστοιχεί στη ποσότητα διαλύματος 0.1 Ν ιωδίου που καταναλώθηκε από το δείγμα (1mL ιωδίου 0.1Ν αντιστοιχεί σε 0.0091 g γλυκόζης).

Ποσοτικός προσδιορισμός γλυκόζης: (Μέθοδος KOLΤHOFF)    S(g/lt)=(Vτ-Vδειγμ.)*0.0091*40*A S(g/lt):τελική συγκέντρωση γλυκόζης Vτ-Vδειγμ :Η διαφορά μεταξύ των δύο ογκομετρήσεων αντιστοιχεί στη ποσότητα διαλύματος 0.1 Ν ιωδίου που καταναλώθηκε από το δείγμα (1mL ιωδίου 0.1Ν αντιστοιχεί σε 0.0091 g γλυκόζης). A:αραιωση δειγματος

Πειραματικό μέρος Σκοπός της άσκησης αυτής είναι: η παρακολούθηση της εξέλιξης μιας μικροβιακής καλλιέργειας Saccharomyces cerevisiae η μέτρηση της μικροβιακής δραστηριότητας μετά από επώαση στους 30ο C σε διαφορετικούς χρόνους (0, 6, 12,18 h) Η χάραξη της καμπύλης ανάπτυξης του μικροοργανισμού

Πειραματικό μέρος Κάθε τμήμα σπουδαστών χωρίζεται σε 4 ομάδες. Κάθε ομάδα έχει στη διάθεσή της μια κωνική φιάλη των 500 mL με 200 mL υγρού θρεπτικού υποστρώματος ως ένα κλειστό σύστημα ζύμωσης (batch) Στο μέσο αυτό θα έχει ήδη αναπτυχθεί ο μικροοργανισμός στους 30C σε διαφορετικούς χρόνους επώασης 0, 6, 12, και 18 ώρες. Σε κάθε ομάδα αντιστοιχεί ένας διαφορετικός χρόνος ζύμωσης.

Αραιώσεις δειγμάτων Ομάδα Χρόνος Ζύμωσης (h) Ξηρό βάρος Α 50mL ----- Ξηρό βάρος Οπτική πυκνότητα Newbauer Kolthoff Α 50mL ----- 1/200 Β 6 1/50 Γ 12 50mL+50mLΗ2Ο 1/10 ---- Δ 18 50mL + 50mLΗ2Ο ---