72120 – ביוכימיה של התא תרגיל מס' 3: קינטיקה אנזימתית

פרמטרים להסתכלות על ריאקציות: תרמודינמיים קינטיים ריאקציות אנזימתיות פרמטרים להסתכלות על ריאקציות: תרמודינמיים קינטיים G- אנרגיה חופשית של גיבס- תלויה באופי החומר וסביבתו, סוג הקשרים הכימיים ומספרם. G- הפרש אנרגטי בין מגיבים לתוצרים, יקבע אם הריאקציה תתרחש או לא (תרמודינמיקה). מהלך ריאקציה כימית ללא קטליזה אנזימתית: מצב יסוד – נק' המוצא של הריאקציה לשני הכיוונים. מצב יציב של המוליקולה שבו יש לה תכולת אנרגיה החופשית אופיינית. אנרגית האקטיבציה (∆G‡) - מכתיבה את קצב הריאקציה, שווה להפרש בין אנרגיית המגיבים לאנרגיית מצב המעבר.

קטליזה - זירוז קצב הריאקציה ע"י הורדת אנרגית האקטיבציה. E + S ES EP E + P מהלך ריאקציה כימית בנוכחות קטליזה אנזימתית: קטליזטורים מגבירים את קצב הריאקציה על ידי הנמכת אנרגית האקטיבציה. אנזימים הם קטליזטורים במערכות ביולוגיות. מצבי מעבר - מצבים בהם הקשרים התארכו/התקצרו ומטענים הועברו כך שאין כברS ועדיין אין P. מצבים שלא ניתן לבודד, קיימים בפסגות הגרף. תוצרי ביניים - מצבים ממשיים של המולקולה שניתנים לבידוד. עמקים בגרף. השלב קובע המהירות - השלב עם אנרגית האקטיבציה הגדולה ביותר ולכן הוא השלב האיטי ביותר בריאקציה. עשוי להשתנות עם שינוי תנאי הריאקציה. קטליזה - זירוז קצב הריאקציה ע"י הורדת אנרגית האקטיבציה.

אנזימים מאופיינים ביעילות קטליטית גבוהה ובספציפיות לסובסטרט. כיצד פועלים אנזימים ? אנזימים מורידים את אנרגית האקטיבציה של הריאקציה ע"י ייצוב מצב המעבר, כלומר הנמכת האנרגיה החופשית שלו.

כיצד פועלים אנזימים ? אנרגית הקשר (ΔGB), שמקורה מאינטראקציות אנזים-סובסטרט, היא המקור העיקרי של אנרגיה חופשית בו אנזימים משתמשים להורדת אנרגית האקטיבציה. אנזימים מאיצים הגעה לשיווי-משקל, אך לא משנים את קבוע שיווי המשקל הריאקציה בכיוון אחד מזורזת בדיוק כמו הריאקציה בכיוון השני.

E + S ES E + P מודל מיכאליס-מנטן בא לתאר מנגנון ריאקציות אנזימתיות: k-1 k1 k2 E + S ES E + P k-2 משוואת מיכאליס-מנטן היא הביטוי האלגברי של העקומה המתארת את היחס בין ריכוז הסובסטרט [S] והמהירות ההתחלתית V0

קינטיקה אנזימתית – מודל מיכאליס-מנטן k-1 k1 k2 E + S ES E + P k-2 הנחות בפיתוח המודל : הנחת קיום קומפלקס ES. הנחת מצב עמיד עבור ES (ריכוזו לא משתנה) : k1>>k2 – השלב הראשון מאוד מהיר. השלב השני הוא האיטי ולכן הוא השלב קובע המהירות. רק K2 יקבע כמה תוצר נקבל: V = k2[ES] ריכוז הסובסטרט [S] גדול בהרבה מריכוז האנזים [E] ולכן ניתן להתייחס אליו כקבוע. כמות התוצר שהופכת חזרה לסובסטרט היא זניחה. כלומר, k-2[E][P] זניח. הנחה זו נכונה רק בתחילת הריאקציה, כאשר V=V0. המודל דן במהירות ההתחלתית של הריאקציה בלבד. כאשר 10%~ מהסובסטרט הפך לתוצר אנחנו כבר לא במצב של מהירות התחלתית V0.

[Et] = [E] + [ES] [E] = [Et] - [ES] פיתוח משוואת מיכאליס-מנטן משוואת מיכאליס-מנטן קובעת את מהירות הריאקציה ההתחלתית כתלות בפרמטרים מדידים: ריכוז האנזים הכולל, ריכוז הסובסטרט וקבועי הריאקציות. מהירות הריאקציה: נגדיר ריכוז אנזים חופשי: [Et] = [E] + [ES] [E] = [Et] - [ES] קצב יצירת ES : קצב פירוק ES: הנחת מצב עמיד עבור ES : נבודד את [ES]:

נגדיר את קבוע-מיכאליס Km: ונציב אותו במשוואה: כעת ניתן להביע את V0 ביחידות של [ES]: מהירות הריאקציה המקסימלית (Vmax) מתקבלת כאשר האנזים במצב רוויה (כלומר ) ולכן: נציב במשוואה ונקבל את משוואת מיכאליס-מנטן

קינטיקה אנזימתית – מודל מיכאליס-מנטן קינטיקה של אנזימים שנצפתה ניסיונית: שינוי במהירות התחלתית כתלות בריכוז הסובסטרט הערך הנמדד הוא מהירות התחלתית (V0) בתנאים בהם [S]>>[E] בגרף אין פרמטר של זמן. כל גרף מתאר את המצב עבור ריכוז אנזים מסוים וקבוע. ככל שריכוז האנזים גבוה יותר,כך V0 ו- Vmax גבוהים יותר. ככל שריכוז הסובסטרט ההתחלתי גבוה יותר, כך יותר מולקולות סובסטרט נקשרות לאנזים,ומהירות הריאקציה ההתחלתית (V0) גדלה.

המהירות ההתחלתית בריכוזי סובסטרט שונים: Km >> [S] : תלות ליניארית של V0 ב [S] [S] >> Km : אין תלות ב [S] Km = [S] : Km הוא ריכוז הסובסטרט בו מהירות הריאקציה היא חצי מהמקסימלית.

משמעות הקבועים : Vmax : מדד לאפקטיביות המקסימלית שניתן להשיג עבור ריכוז אנזים מסוים. המהירות המקסימלית מושגת כאשר [ES] מקבל את הערך הגבוה ביותר, כלומר כל מולקולות האנזים קושרות סובסטרטים (רוויה) : Km : מבטא את היחס בין הגורמים שמפרקים את ES לגורם שיוצר אותו, פרמטר שמעיד על יציבות הקומפלקס ES : מבוטא ביחידות של ריכוז. שווה לריכוז הסובסטרט הדרוש על-מנת להגיע למהירות חצי-מקסימלית. kcat: קבוע קצב כללי המבטא את השלב קובע-המהירות במצב רוויה. מבטא את מספר מולקולות הסובסטרט שמולקולת אנזים אחת יכולה להפוך לתוצר ביחידת הזמן הנתונה, כאשר האנזים רווי. נקרא גם turnover number. בעל יחידות של תדירות (זמן / 1). kcat / Km: מדד ליעילות קטליטית של האנזים. נקרא גם קבוע הספציפיות.

לינאריזצית Lineweaver - Burk משוואת מיכאליס-מנטן - ניקח את ההפכי של שני צידי המשוואה: Lineweaver-Burk Equation

מעכבים בלתי הפיכים: נקשרים לחלבון באופן בלתי הפיך. הפיכים: מעכבים תחרותיים – מתחרים כנגד הסובסטרט על אתר הקישור של החלבון. מעכבים בלתי תחרותיים – קושרים אתרים אחרים בחלבון ומפריעים לפעילותו.

עיכוב תחרותי

עיכוב תחרותי

עיכוב תחרותי BOX 6-2 FIGURE 1 Competitive inhibition.

עיכוב בלתי תחרותי

עיכוב בלתי תחרותי BOX 6-2 FIGURE 2 Uncompetitive inhibition.

עיכוב בלתי תחרותי BOX 6-2 FIGURE 2 Uncompetitive inhibition.

עיכוב מעורב

עיכוב מעורב BOX 6-2 FIGURE 3 Mixed inhibition.

עיכוב הפיך

עיכוב noncompetitive מקרה מיוחד של מעכב לא-תחרותי קושר את החלבון באתר אחר, אך אינו מפריע לסובסטרט לקשור את החלבון ומתקבל:

עיכוב noncompetitive 1/Vmax -1/Km

שאלה 1: העריכו את ערכי Vmax ו- Km מהטבלה (ללא גרפים) תשובה: על פי הטבלה ניתן לראות ש-Vmax הוא ~140 M/min. Km הוא ריכוז הסובסטרט בו המהירות ההתחלתית היא מחצית מהמהירות המקסימלית. לכן Km הוא ריכוז הסובסטרט כאשר המהירות היא ~70 M/min מכאן ש- Km=10-5 M.

ג ב א שאלה 2: אנזים המקטלז ריאקציה מסוימת הוסף ב-3 ריכוזים שונים, אנזים המקטלז ריאקציה מסוימת הוסף ב-3 ריכוזים שונים, איזה מהגרפים הבאים מתארים נכון את תוצאות ניסוי הקינטיקה שביצעת? ג ב א פיתרון: אם כמות האנזים גדלה ( Etעולה) Vmax יגדל כי Vmax k2[ET] = . Km אינו תלוי בריכוז האנזים ע"פ הנוסחה: Km = /k1 (k-1 + k2) ולכן יישאר קבוע. הגרף המתאים לכך הוא גרף ב, נקודת החיתוך עם ציר X (כלומר Km) קבועה, השיפוע ונקודת החיתוך עם ציר Y (ערכים בהם Vmaxמעורב משתנים).

שאלה 3: כתוצאה מהעלאת ריכוז הסובסטראט מ- 0.05mM ל- 0.2mM(פי 4), עלתה מהירות הריאקציה המקוטלזת פי 2.5. עם זאת, עליית ריכוז הסובסטראט מ- 5mM ל- 20mMהביאה לעליית מהירות של 14% בלבד. איזה מההסברים הוא הסביר ביותר? ריכוז גבוה של סובסטראט מעכב את פעילות האנזים. כאשר אנזים מגיע למצב רווי, Km עולה. בריכוז סובסטראט של 5mM מרבית האתרים הפעילים של האנזים רווים. החישוב מתאים למודל בו הסובסטראט פועל כמעכב תחרותי. פיתרון: תשובה 3 5 20 0.05 0.2

CH3CHO + NAD+ ⇌ CH3COO- + NADH +H+ שאלה 4: בקרב אסיאתים נפוצה מוטציה המשנה חומצה אמינית אחת (E487K) ברצף של האנזים אלדהיד דהידרוגנז. כתוצאה מכך, האנשים הנושאים את המוטציה רגישים יותר למשקאות אלכוהוליים (האצת דופק, הסמקה). האפקט הפיזיולוגי הוא תוצאה של הצטברות אצטאלדהיד המיוצר ע"י האנזים אלכוהול דהידרוגנז. אצטאלדהיד בד"כ מסולק ע"י אלדהיד דהידרוגנז ההופך אצטאלדהיד לאצטט בריאקציה: CH3CHO + NAD+ ⇌ CH3COO- + NADH +H+ מה יכול להיות הסבר אפשרי לתופעה: 1. ש.מ. של הריאקציה מוסט בעקבות המוטציה. 2. Vmax של הריאקציה עולה באופן דרמטי (כמעט מכפיל את עצמו). 3. Km עולה (מ 30μM ל ~7000 μM) 4. בעקבות המוטציה האפיניות של האנזים לסובסטרט עולה פי 1.5 תשובה: 3