Εφαρμογές Laser στη βιολογία -Βιοαισθητήρες Ευαγγελία Σαραντοπούλου Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών Ινστιτούτο Θεωρητικής και Φυσικής Χημείας

Οργάνωση παρουσίασης Ορισμός & Αρχή λειτουργίας βιοαισθητήρα Aπαιτήσεις βιοαισθητήρα Βιοσυστοιχίες Σχεδιασμός πρωτεϊνικής μικροσυστοιχίας Υπόστρωμα Εγγραφή δομών Κατασκευή βιοσυστοιχιών με υπεριώδη ακτινοβολία λέιζερ Περίθλαση Απλή σχισμή-Διπλή σχισμή Διακριτική ικανότητα

Ορισμός Οι βιοαισθητήρες είναι αναλυτικές συσκευές οι οποίες χρησιμοποιούν βιολογικές αλληλοεπιδράσεις για να παρέχουν πληροφορίες ποιοτικές ή ποσοτικές.

Αρχή λειτουργίας βιοαισθητήρα Δείγμα (analyte) Μετατροπέας σήματος αντισώματα Biοανυχνευτής (Bioreceptor) ένζυμα Μετατρέπει το σήμα που προκύπτει από την αλληλοεπίδραση του δείγματος με τον βιοκαταλλυτη σε σήμα μετρήσιμο και ποσοτικοποιήσιμο Μετατροπέας (Tranducer) Σήμα (Signal) Φως, ρεύμα CCD camera

Δείγμα (analyte) Δείγμα Biοανυχνευτής (Bioreceptor) Μετατροπέας σήματος Biοανυχνευτής (Bioreceptor) Μετατροπέας (Tranducer)

Απαιτήσεις Επιλεξιμότητα Σταθερότητα Χαμηλό όριο ανίχνευσης Δείγμα (analyte) Δείγμα Επιλεξιμότητα Σταθερότητα Χαμηλό όριο ανίχνευσης Επαναληψημότητα Ταχύτητα απόκρισης Μετατροπέας σήματος Bioκαταλύτης (Bioreceptor) Ευαισθησία Επαναληψημότητα Σταθερότητα Να μην επηρεάζεται από ηλεκτρικές ή περιβαλλοντικές παρεμβάσεις Χαμηλό κόστος Μετατροπέας (Tranducer) Σήμα (Signal) ρεύμα, χρώμα

Βιοσυστοιχία-bioarray Προτοτυποποιημένο, προπαρακευασμένο υπόβαθρο σε πολλαπλή διευθέτηση για παράλληλη ανίχνευση και επεξεργασία πολλών δειγμάτων ( πιστοποίηση της ύπαρξης εκατοντάδων πρωτεϊνών ή γονιδίων ταυτόχρονα)

Σχεδιασμός βιοσυστοιχίας Υπόστρωμα : πλαστικό, γυαλί, SiO2, Au Πλακίδιο πολυστυρενίου (Z max 3 nm) Πλακίδιο πολυστυρενίου επιστρωμένο με πρωτεΐνη BSA Bovine serum albumin (Z max 10 nm)

Εγγραφή δομών Εγγραφή δομών στην επιφάνεια : Ink-jet printing ~200μm Εγγραφή δομών Εγγραφή δομών στην επιφάνεια : Ink-jet printing ~200μm Εκτύπωση επαφής (Contact printing) ~200μm Μικρολιθογραφία : μάσκες, δομές ~20μm Μηχανική Εγχάραξη- ρομποτικά συστήματα Πυκνότητες 10.000 – 250.000 spots per cm2 . Με τις μικροσυστοιχίες είναι πλέον δυνατό να μειωθεί ο όγκος ανά αντίδραση σε λίγα δισεκατομμυριοστά ενός λίτρου του διαλύματος Ανάγνωση με πολύπλοκα ρομποτικά συστήματα (laser scanners) Στόχος : αύξηση της πυκνότητας εγγραφής δομών Λέιζερ (248 nm, 193 nm, 157 nm)

κατασκευή βιοσυστοιχιών με υπεριώδη ακτινοβολία λέιζερ κατασκευή βιοσυστοιχιών με υπεριώδη ακτινοβολία λέιζερ Η ικανότητα ενός συστήματος να προβάλει ευκρινώς την εικόνα μιας μικρής δομής (OO’) σε ένα υπόστρωμα (W) εξαρτάται από το μήκος κύματος το οποίο χρησιμοποιείται : Resolution limited by diffraction W S S ελάχιστη (κρίσιμη) διάσταση Σύγχρονα συστήματα λιθογραφίας χρησιμοποιούν μήκη κύματος στο βαθύ υπεριώδες (193 nm) τα οποία επιτρέπουν ελάχιστη διάσταση 90 nm (dry lithography) και 40 nm (water immersion)

157 nm Εκτεταμένα Εντοπισμένα θερμικά θερμικά φαινόμενα φαινόμενα

Ενεργοποίηση της επιφάνειας Απόδοση στην ανίχνευση  Ισχυρός δεσμός πρωτεΐνης –υποστρώματος Φως-ακτινοβολία λέιζερ : διασπά δεσμούς υποστρώματος  τροποποίηση της επιφάνειας με ταυτόχρονη εγγραφή δομών Κόκκινο (streptavidin ) Μπλε (anti-mouse IgG antibody ) Πράσινο (anti-rabbit IgG antibody )

Συμβολή Δύο σχισμές Young Οι πηγές να είναι μονοχρωματικές Οι πηγές να είναι σύμφωνες (να έχουν σταθερή διαφορά φάσης) Μη ομοιόμορφη κατανομή της φωτεινής ενέργειας στο χώρο → δημιουργία κροσσών συμβολής d sinθ=m * λ , m=0,±1, ±2 d sinθ=(m+1/2) * λ, m=0,±1, ±2 Ενισχυτική συμβολή Καταστροφική συμβολή

Το πλάτος Α είναι σταθερό και για τις 2 πηγές y1(t)=Acos(ωt-kr1+φ1) y2(t)=Acos(ωt-kr2+φ2) Το πλάτος Α είναι σταθερό και για τις 2 πηγές Το συνιστάμενο κύμα στο Ρ είναι, y(t)=y1(t)+y2(t) =Acos(ωt-kr1+φ1)+Acos(ωt-kr2+φ2) = 2Acos(ωt – kr+ φ) cos (k (r2-r1)/2 +δ)= όπου r=(r1+r2)/2, φ=(φ1+φ2)/2, δ=(φ1-φ2)/2. Από σχήμα βλέπουμε ότι η διαφορά δρόμου (r2-r1)≈dsinθ, άρα y(t)=Â cos(ωt-kr+φ) Όπου Â= 2 Α cos ( k dsinθ/2 +δ) Αν δ=(φ1-φ2)/2=0, οπότε μπορούμε να βρούμε πιο εύκολα τα μέγιστα και ελάχιστα του πλάτους του συνιστάμενου οδεύοντος κύματος. Â= 2 Α cos ( k dsinθ/2)= 2Α όταν kdsinθ/2=m π 0 όταν kdsinθ/2=(m+1/2) π

Η ένταση ενός κύματος είναι ανάλογη του τετραγώνου του πλάτους, οπότε: Ένταση Η ένταση ενός κύματος είναι ανάλογη του τετραγώνου του πλάτους, οπότε: Ι=4 Ι0 cos2 a όπου a=(π*d/λ) sinθ                                               Ι είναι η συνισταμένη ένταση στο σημείο Ρ, ενώ Ι0 είναι η ένταση στο σημείο Ρ εξαιτίας μόνο της μιας πηγής. Για να έχουμε ενισχυτική συμβολή πρέπει   a=nπ          οπότε η ένταση είναι             Για να έχουμε αποσβεστική συμβολή πρέπει                    οπότε η ένταση είναι μηδέν. Ενισχυτική συμβολή I=22 I0. Αποσβεστική συμβολή  I=0.

Περίθλαση Fraunhofer σε απλή σχισμή: Διαστάσεις οπών της ίδιας τάξης μεγέθους προς το μήκος κύματος → Το φαινόμενο της περίθλασης   Μη ευθύγραμμη διάδοση του φωτός όταν προσπίπτει στα όρια των εμποδίων. Σύμφωνα με τη αρχή του Huygens, όταν ένα κύμα συναντήσει μια σχισμή όλα τα σημεία της σχισμής δρουν σαν δευτερογενείς πηγές κυμάτων. Oπότε μπορούμε να μελετήσουμε την περίθλαση από μια σχισμή σαν συμβολή κυμάτων που προέρχονται από άπειρες όμοιες πηγές. Εάν δεν εμφανίζεται περίθλαση ελάχιστα Περίθλαση Fraunhofer σε απλή σχισμή: Οι ακτίνες που προσπίπτουν καθώς και οι ακτίνες που φτάνουν στο σημείο παρατήρησης είναι σχεδόν παράλληλες

Περίθλαση σε διπλή σχισμή Διπλή σχισμή ένταση Ι μετά τη σχισμή θα δίνεται από τη σχέση: Υπάρχουν μέγιστα και ελάχιστα που είναι συνδυασμός του παράγοντα περίθλασης και του παράγοντα συμβολής. α d http://www.phy.davidson.edu/StuHome/grpatterson /Diffraction%20and%20Spatial%20Filtering/double_slit1.htm

Το μήκος κύματος είναι 600nm Περίθλαση Fraunhofer από μία σχισμή της οποίας μεταβάλλεται το εύρος (500-1500 nm) Το εύρος των σχισμών (1000nm) είναι σταθερό και η απόσταση μεταξύ τους μεταβάλλεται (1000-10000 nm). Η πυκνότητα των κροσσών αυξάνεται ανάλογα με την απόσταση των σχισμών Εύρος σχισμών μεταβάλλεται , η απόσταση μεταξύ τους είναι σταθερή. Στενές σχισμές →pattern περίθλασης είναι ευρύτερο http://physics-animations.com/Physics/English/DG10/DG.htm

θ>=1.22 λ/D Διακριτική ικανότητα Ποια είναι η ελάχιστή γωνία (όριο διάκρισης) που θα πρέπει να σχηματίζουν δύο πηγές με κορυφή την σχισμή ώστε τα είδωλά τους να διακρίνονται ? (κριτήριο Rayleigh.) Η γωνιακή απόσταση κέντρων δύο κύριων φωτεινών κυκλικών κροσσών >ή = της γωνιακής απόστασης του πρώτου σκοτεινού κροσσού. ή όταν το μέγιστο του ενός πέφτει επάνω στο πρώτο ελάχιστο του άλλου Κριτήριο του Rayleigh. θ>=1.22 λ/D

Φράγμα περίθλασης –Diffraction grating