ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Γ΄ Τάξη Λυκείου Θετικής Κατεύθυνσης Άσκηση 1 Εργαστηριακού οδηγού : Απομόνωση νουκλεϊκών οξέων 2ο ΕΚΦΕ ΗΡΑΚΛΕΙΟΥ 2008-2009 Επιμέλεια: Κωτίτσας Αριστοτέλης

Παρακάτω παρουσιάζεται το πείραμα σε πιο απλοποιημένη μορφή από ότι στο σχολικό οδηγό, αντί για κρεμμύδι χρησιμοποιούμε μπανάνα, οπότε δε θα χρειαστούμε μπλέντερ κουζίνας και αντί για πεψίνη, χρησιμοποιούμε υγρό φακών επαφής Εάν θέλετε να πραγματοποιήσετε το πείραμα σύμφωνα με τον εργαστηριακό οδηγό πατήστε το βελάκι

Όργανα και υλικά Υδατόλουτρο (ή ένα κατσαρολάκι με ζεστό νερό) δύο ποτήρια ζέσεως 250 mL ένα κουτάλι σούπας ή πιπέτα ή σύριγγα των 10mL γυάλινος δοκιμαστικός σωλήνας γυάλινη ράβδος ανάδευσης ένα χωνί φίλτρο του καφέ στήριγμα δοκιμαστικών σωλήνων πάγος τριμμένος μια μπανάνα υγρό πιάτων (όχι συμπυκνωμένο), ή σαμπουάν 10 mL μαγειρικό αλάτι 3 g αποσταγμένο νερό 100 mL αιθανόλη 6 mL, παγωμένη (-20 °C) (μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε και μπλε οινόπνευμα) υγρό φακών επαφής ένα πλαστικό σακουλάκι Όργανα και υλικά

Υλικά και όργανα δοκιμαστικός σωλήνας γυάλινη ράβδος ανάδευσης φίλτρο του καφέ Αποσταγμένο νερό 100 mL μεγάλο χωνί υδατόλουτρο αιθανόλη 6 mL υγρό πιάτων μια μπανάνα μαγειρικό αλάτι πάγος τριμμένος υγρό φακών επαφής δύο ποτήρια ζέσεως 250 mL ένα πλαστικό σακουλάκι κουτάλι σούπας

Παίρνουμε, μια κουταλιά της σούπας, ή με την πιπέτα 10 mL υγρό πιάτων (όχι συμπυκνωμένο) και λίγο λιγότερο από μισή κουταλιά της σούπας μαγειρικό αλάτι (εάν έχουμε ζυγαριά ζυγίζουμε 3 g)

Σ' ένα ποτήρι ζέσεως βάζουμε το υγρό πιάτων, το μαγειρικό αλάτι και συμπληρώνουμε με αποσταγμένο νερό μέχρι όγκου 100 mL Ανακατεύουμε το μείγμα ώσπου να διαλυθεί όλο το αλάτι

Καθαρίζουμε και στη συνέχεια πολτοποιούμε τη μπανάνα Καθαρίζουμε και στη συνέχεια πολτοποιούμε τη μπανάνα. (Μπορούμε να τοποθετήσουμε τη μπανάνα μέσα σε ένα πλαστικό σακουλάκι, μαζί με λίγο από το διάλυμα που παρασκευάσαμε και στη συνέχεια να την πολτοποιήσουμε με τα χέρια, πιέζοντάς την μέσα στο σακουλάκι.)

Προσθέτουμε στην πολτοποιημένη μπανάνα το διάλυμα απορρυπαντικού - αλατιού αναδεύοντας συνεχώς και τοποθετούμε το ποτήρι ζέσεως για 15 λεπτά στο υδατόλουτρο στους 50-55°C. (Προσοχή η θερμοκρασία δεν πρέπει να ξεπεράσει τους 55°C). Εάν δεν υπάρχει υδατόλουτρο, χρησιμοποιούμε μια λεκάνη στην οποία έχουμε βάλει ζεστό νερό

πυρήνας Τι συμβαίνει εδώ; πλασματική μεμβράνη κύτταρο μπανάνας Το DNA περιβάλλεται από τον πυρηνικό φάκελο, ο οποίος περιβάλλεται από την πλασματική μεμβράνη του κυττάρου. Χρησιμοποιώντας το απορρυπαντικό σπάζουμε τις μεμβράνες και απελευθερώνουμε το DNA.

απορρυπαντικό + φωσφολιπίδια Το μόριο των απορρυπαντικών και των φωσφολιπιδίων αποτελείται από μια υδρόφιλη κεφαλή και μια υδρόφοβη ουρά. Τα μόρια και των δύο, όταν βρεθούν σε υδάτινο περιβάλλον, οργανώνονται σε φυσαλίδες με τις κεφαλές προς τα έξω (σε επαφή με το νερό) και τις ουρές προς το εσωτερικό (μακριά από το νερό). Επειδή το απορρυπαντικό έχει παρόμοια δομή με τα φωσφολιπίδια, όταν έρχονται σε επαφή τα μόρια τους, δημιουργούν φυσαλίδες απορρυπαντικού-φωσφολιπιδίων φωσφολιπίδια απορρυπαντικό απορρυπαντικό + φωσφολιπίδια

τη θραύση των μεμβρανών και την απελευθέρωση του DNA Ανάμεσα στη διπλοστοιβάδα των φωσφολιπιδίων των μεμβρανών, παρεμβάλλονται μόρια πρωτεϊνών. Το απορρυπαντικό συλλαμβάνει τα φωσφολιπίδια και τις πρωτεΐνες με τελικό αποτέλεσμα τη θραύση των μεμβρανών και την απελευθέρωση του DNA απορρυπαντικό απορρυπαντικό+ φωσφολιπίδια & πρωτεΐνες πλασματική μεμβράνη

Τοποθετούμε το ποτήρι ζέσεως στον τριμμένο πάγο, για 5 λεπτά, ανακατεύοντας συχνά το μείγμα (κάθε μισό λεπτό περίπου). Για να θρυμματίσουμε τον πάγο, τον τοποθετούμε σε μια σακούλα και τον χτυπάμε με ένα σφυρί Τοποθετούμε το φίλτρο του καφέ στο χωνί και φιλτράρουμε το μείγμα. Συλλέγουμε το διήθημα στο δεύτερο ποτήρι ζέσεως.

Το υδατόλουτρο στους 50-55 °C επιταχύνει τη διαδικασία της λύσης των κυττάρων, ενώ ταυτόχρονα αδρανοποιούνται και πολλές από τις νουκλεάσες των ίδιων των κυττάρων. Οι νουκλεάσες είναι ένζυμα που βρίσκονται στο κυτταρόπλασμα και λύουν το DNA, προστατεύοντας το κύτταρο από την είσοδο ξένου DNA (ιών). Ο πάγος βοηθά να παραμείνει το DNA ανέπαφο επιβραδύνοντας τις ενζυμικές αντιδράσεις που θα το κατέστρεφαν

Από το διήθημα παίρνουμε περίπου 10 mL (δυο με τρία δάκτυλα), και τα τοποθετούμε στο δοκιμαστικό σωλήνα Στάζουμε 2-3 σταγόνες υγρού φακών επαφής ανακινώντας ελαφρά Προσθέτουμε με προσοχή, σχεδόν ίση ποσότητα παγωμένης αιθανόλης (-20 °C), ώστε να σχηματιστεί ένα στρώμα επάνω από το διάλυμά μας.

πρωτεΐνες Το υγρό των φακών επαφής περιέχει ένζυμα που διασπούν τις πρωτεΐνες (ιστόνες) με τις οποίες πακετάρεται το DNA. Μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε και χυμό ανανά ή πεψίνη εφόσον υπάρχει. Τα Na+ του NaCl εξουδετερώνουν τα ιόντα του φωσφορικού οξέως του DNA και έτσι αυτό συμπυκνώνεται και γίνεται ορατό.

Τοποθετούμε τον δοκιμαστικό σωλήνα στο στήριγμα και περιμένουμε 2-3 λεπτά. Τα νουκλεϊκά οξέα συγκεντρώνονται στην επιφάνεια επαφής διαλύματος/αιθανόλης και «ανεβαίνουν». Εάν δεν εμφανίζεται τίποτα, ή εμφανίζονται ελάχιστα νουκλεϊκά οξέα, προσθέτουμε λίγες σταγόνες διαλύματος NaCl, για να βοηθήσουμε τη συμπύκνωση τους DNA Συνηθισμένη εικόνα Εικόνα στην καλύτερη περίπτωση DNA Οι φυσαλίδες οφείλονται στον αέρα που ελευθερώνεται καθώς ζεσταίνεται η αλκοόλη Μπορούμε να τα συλλέξουμε με μια ξύλινη ράβδο.

Οι υδρόφοβες αζωτούχες βάσεις των νουκλεϊκών οξέων έλκονται από το υδρόφοβο τμήμα της αλκοόλης και συγκεντρώνονται στην επιφάνεια επαφής διαλύματος / αιθανόλης. Επειδή το DNA είναι αδιάλυτο στην αλκοόλη γίνεται ορατό ως λευκά συσσωματώματα Καλή επιτυχία

Kάντε κλικ πάνω στην ιστοσελίδα για να μεταφερθείτε σε ένα εικονικό εργαστήριο απομόνωσης ανθρώπινου DNA. (Απαραίτητη η σύνδεση στο διαδίκτυο) http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/extraction/

Υλικά και όργανα (σύμφωνα με τον εργαστηριακό οδηγό) υδατόλουτρο μπλέντερ κουζίνας κοφτερό μαχαίρι δύο ποτήρια ζέσεως 250 mL πιπέτα ή σύριγγα των 10mL γυάλινος δοκιμαστικός σωλήνας γυάλινη ράβδος ανάδευσης μεγάλο πλαστικό χωνί φίλτρο του καφέ στήριγμα δοκιμαστικών σωλήνων πάγος τριμμένος ένα κρεμμύδι υγρό πιάτων (όχι συμπυκνωμένο) 10 mL μαγειρικό αλάτι 3 g αποσταγμένο νερό 100 mL αιθανόλη 6 mL, παγωμένη (-20 °C) διάλυμα ενζύμου (πρωτεϊνάσης 0,1 g/100 mL ή πεψίνης 1 g/100mL) Υλικά και όργανα (σύμφωνα με τον εργαστηριακό οδηγό) Για να γυρίσετε πίσω πατήστε το βελάκι

Υλικά και όργανα μαγειρικό αλάτι μπλέντερ κουζίνας φίλτρο του καφέ κοφτερό μαχαίρι υδατόλουτρο υγρό πιάτων μεγάλο χωνί αιθανόλη 6 mL Αποσταγμένο νερό 100 mL πιπέτα των 10mL ένα κρεμμύδι δύο ποτήρια ζέσεως 250 mL πάγος τριμμένος γυάλινη ράβδος ανάδευσης διάλυμα ενζύμου δοκιμαστικός σωλήνας

Με την πιπέτα παίρνουμε 10 mL υγρό πιάτων (όχι συμπυκνωμένο) Ζυγίζουμε 3 g μαγειρικό αλάτι

Σ' ένα ποτήρι ζέσεως βάζουμε το υγρό πιάτων, το μαγειρικό αλάτι και συμπληρώνουμε με αποσταγμένο νερό μέχρι όγκου 100 mL Ανακατεύουμε το μείγμα ώσπου να διαλυθεί όλο το αλάτι

Κόβουμε το κρεμμύδι σε κύβους (ακμής 0,5 cm περίπου) και το προσθέτουμε στο μείγμα.

Τοποθετούμε το ποτήρι ζέσεως στον τριμμένο πάγο, για 5 λεπτά, ανακατεύοντας συχνά το μείγμα (κάθε μισό λεπτό περίπου). Ρίχνουμε το μείγμα στο μπλέντερ και ανακατεύουμε για 5 δευτερόλεπτα. (ΠΡΟΣΟΧΗ: Ο χρόνος ανάδευσης να τηρηθεί αυστηρά.)

Τοποθετούμε το φίλτρο του καφέ στο χωνί και φιλτράρουμε το μείγμα. Συλλέγουμε το διήθημα στο δεύτερο ποτήρι ζέσεως. Με την πιπέτα ή με τη σύριγγα αφαιρούμε 10mL διηθήματος και τα μεταφέρουμε στον δοκιμαστικό σωλήνα

Προσθέτουμε 2-3 σταγόνες διαλύματος του ενζύμου και ανακατεύουμε ελαφρά. (0,1 g πρωτεϊνάσης σε 100 mL νερό ή 1 g πεψίνης σε 100 mL νερό) Στη συνέχεια, προσθετούμε την παγωμένη αιθανόλη (-20 °C) με προσοχή, ώστε να σχηματιστεί ένα στρώμα επάνω από το διάλυμά μας.

Εικόνα στη χειρότερη περίπτωση DNA Τοποθετούμε τον δοκιμαστικό σωλήνα στο στήριγμα και περιμένουμε 2-3 λεπτά. Τα νουκλεϊκά οξέα συγκεντρώνονται στην επιφάνεια επαφής διαλύματος/αιθανόλης και «ανεβαίνουν». Εικόνα στην καλύτερη περίπτωση DNA Μπορούμε να τα συλλέξουμε με μια ξύλινη ράβδο. Καλή επιτυχία Συνηθισμένη εικόνα DNA