ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΝΑΛΥΤΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΑΝΑΛΥΤΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ ΙΙΙ Αμπερομετρία ΜΑΜΑΝΤΟΣ ΠΡΟΔΡΟΜΙΔΗΣ ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ http://users.uoi.gr/mprodrom

Βολταμμετρικές τεχνικές Βολταμμετρικές τεχνικές: Βασίζονται στην παρατήρηση της σχέσης που συνδέει την ένταση του ρεύματος και την εφαρμοζόμενη τάση κατά τη διάρκεια μιας ηλεκτροχημικής διαδικασίας Βολταμμετρία I = f (V) με κάποιο πολώσιμο ηλεκτρόδιο. Πολαρογραφία I = f (V) με πολώσιμο ηλεκτρόδιο Ηg. Αμπερομετρία I = f (VWE = σταθερό) με κάποιο πολώσιμο ηλεκτρόδιο

Κυψελίδα 2-ηλεκτροδίων Εεφ i A Α/Η ΗΕ

Κυψελίδα 3-ηλεκτροδίων Εεφ i A i = 0 R ΒΗ ΗΕ

Αρχή λειτουργίας ποτενσιοστάτη i V R W C Ρυθμιζόμενη πηγή τάσης C W R Βρόχος ανατροφοδότησης Μέτρηση δυναμικού Συγκριτής/ Ενισχυτής Επιθυμητή τιμή Vw Ποτενσιοστάτης

Πειραματική διάταξη Ποτενσιοστάτης ΕΗΕ = σταθερό Βοηθητικό Ηλεκτρόδιο αναφοράς Βοηθητικό ηλεκτρόδιο Ηλεκτρόδιο εργασίας

Προϋποθέσεις για την εκτέλεση ενός «σωστού» πειράματος Κυψελίδα 3-ηλεκτροδίων και χρήση ποτενσιοστάτη Το ηλεκτρόδιο αναφοράς τοποθετείται κοντά στο ηλεκτρόδιο εργασίας. Η αντίσταση του διαλύματος μεταξύ αυτών να είναι όσον το δυνατό μικρή. Το βοηθητικό ηλεκτρόδιο έχει μεγάλη επιφάνεια σε σχέση με το ηλεκτρόδιο εργασίας. Το ρεύμα να διέρχεται σχεδόν κατά αποκλειστικότητα μέσω αυτού, ενώ το ρεύμα που διέρχεται από το ΗΑ, σε συνδυασμό με κατάλληλες διατάξεις, να είναι πολύ μικρό. Το διάλυμα του ηλεκτρολύτη πρέπει να έχει υψηλή αγωγιμότητα. Προσθήκη μεγάλης συγκέντρωσης μη ηλεκτρενεργού άλατος, συνήθως σε συνδυασμό με κάποιο ρυθμιστικό διάλυμα. Οι μετρήσεις γίνονται υπό ανάδευση. Η μεταφορά μάζας στην επιφάνεια του ηλεκτροδίου να είναι σημαντική.

Άμεση αμπερομετρία Μέτρηση του ρεύματος που προκύπτει από την οξείδωση ή την αναγωγή οποιασδήποτε ηλεκτρενεργής ουσίας βρίσκεται στο διάλυμα Περιορισμένη εκλεκτικότητα σε σύνθετα δείγματα (βιολογικά υγρά) Αναλύτες με διαφορετικά δυναμικά αναγωγής Απαιτούμενο δυναμικό / mV Παλαίωση της επιφάνειας του ηλεκτροδίου εργασίας σταδιακή μείωση της ενεργότητας του ηλεκτροδίου εργασίας λόγω προσρόφησης ουσιών που υπάρχουν στο δείγμα ή δημιουργούνται κατά τη διάρκεια της ηλεκτροχημικής μέτρησης

Ορισμός ……………………… Βιοαισθητήρας ονομάζεται το σύστημα δύο μεταλλακτών, ενός χημικού και ενός φυσικού, οι οποίοι βρίσκονται σε επαφή και μετατρέπουν τη συγκέντρωση του αναλύτη σε μετρούμενο σήμα… Βιοχημικός Μεταλλάκτης Ένζυμο Φυσικός Ηλεκτρόδιο ΗΛΕΚΤΡΕΝΕΡΓΗ ΟΥΣΙΑ ΑΝΑΛΥΤΗΣ

Ένζυμα Πρωτεΐνη που καταλύει μια βιοχημική αντίδραση. Το ένζυμο επιταχύνει την αντίδραση κατά πολλές τάξεις μεγέθους Αποτελείται από αμινοξέα Ενεργό κέντρο (Τμήμα αλυσίδας αμινοξέων) Υψηλή εξειδίκευση σε ένα υπόστρωμα (κλειδί-κλειδαριά)

Μέθοδοι ακινητοποίησης ενζύμων

Πιθανές διαμορφώσεις ακινητοποιημένου ενζύμου Βιομόριο Θέσεις σύνδεσης Φορέας ακινητοποίησης Προσανατολισμός – Ακαμψία σύνδεσης

Χημικές μέθοδοι ακινητοποίησης Αμινοξέα Αμινοξύ 1αγής δομή πρωτεϊνών Κυστείνη Γλουταμινικό οξύ Ασπαρτικό οξύ Λυσίνη Θρεονίνη Φορέας ΝΗ2 SH COOH HO Φορέας: Ηλεκτρόδια γραφίτη ή χρυσού, μεμβράνες Nylon

Μέθοδος καρβοδιϊμιδίων / -COOH/NH2 (CH 2 ) 3 + H(CH Cl - CH EDC H2 NHS -ΝΗ2 EDC: Ν–αιθυλο–Ν΄–(3–διμεθυλοαμινοπροπυλο)καρβοδιϊμίδιο NHS: Ν–υδροξυηλεκτριμίδιο C O EDC/NHS N OH NH Ε NH2

Μέθοδος γλουταραλδεύδης - NH2/ΝΗ2

Αμπερομετρικός βιοαισθητήρας γλυκόζης Ηλεκτρόδιο Οξυγόνου Ηλεκτρόδιο Η2Ο2 Γλυκόζη + Ο2 Γλυκονολακτόνη + Η2Ο2 GOx ΓΛΥΚΟΖΗ Η2Ο2 Ακινητοποιημένη Οξειδάση της γλυκόζης (GOx) Ηλεκτρόδιο Au ή Pt

Ηλεκτρόδιο Οξυγόνου – Ηλεκτρόδιο Clark Το Ο2 σε διάλυμα μετρείται αμπερομετρικά, με κάθοδο Pt στα -0,6 V ως προς ηλεκτρόδιο αναφοράς Ag/AgCl. Το στοιχείο καλύπτεται από μια ημιπερατή μεμβράνη, μέσω της οποίας διαχέεται το Ο2, το οποίο ανάγεται σύμφωνα με την αντίδραση Ηλεκτροχημική αναγωγή Ο2 O2 + 4H+ + 4e- → 2H2O E < ‒0,6 V Σύρμα Ag/AgCl Σύρμα Pt Εσωτερικό διάλυμα αναφοράς, KCl Μεμβράνη

Ηλεκτρόδιο Η2Ο2 H2O2 → O2 + 2H+ + 2e- , E > 600 mV Το Η2Ο2 σε διάλυμα μετρείται αμπερομετρικά, με Au ή Pt σύμφωνα με τις παρακάτω αντιδράσεις: Ηλεκτροχημική οξείδωση / αναγωγή Η2Ο2 H2O2 → O2 + 2H+ + 2e- , E > 600 mV H2O2 + 2H+ + 2e- → 2H2O, E < -400 mV MEIONEKTHMATA Εκλεκτικότητα Παλαίωση της επιφάνειας του ηλεκτροδίου

Αμπερομετρικός βιοαισθητήρας γλυκόζης

Αποκλεισμός σωματιδίων λόγω μεγέθους ή φορτίου Ηλεκτρόδιο Οξική κυτταρίνη Αρνητικά φορτισμένη μεμβράνη Πολυκαρβονυλική

Εμπορικά διαθέσιμοι βιοαισθητήρες

Μέθοδος καμπύλης αναφοράς Γενική σχέση : Μετρούμενη ιδιότητα = f ([αναλύτη]) Αμπερομετρία : Ι = f ([αναλύτη]) Με τη μέθοδο των ελαχίστων τετραγώνων χαράζουμε την ευθεία παλινδρόμησης (y=a+bx) Ι = a+b ([ΑΓΝΩΣΤΟΥ]) a= η αρχή επί της τεταγμένης b= κλίση της καμπύλης αναφοράς I / μΑ [αναλύτη] / mM

Αμπερομετρικές ογκομετρήσεις Καταγραφή του ρεύματος (Ι) που διαρρέει τη βολταμμετρική κυψελίδα ως συνάρτηση του όγκου (V) του τιτλοδότη. (Ι) = f (VΤΙΤΛΟΔΟΤΗ) ΠΡΟΫΠΟΘΕΣΕΙΣ ο τιτλοδότης (Τ) ή η ογκομετρούμενη ουσία (Ο) ή ΗΛΕΚΤΡΕΝΕΡΓΕΣ ΟΥΣΙΕΣ το προϊόν της αντίδρασης (Π) Το δυναμικό του ηλεκτροδίου εργασίας να είναι μεγαλύτερο από το υπερδυναμικό που απαιτείται για την οξείδωση ή την αναγωγή της ηλεκτρενεργής ουσίας ΤΟΤΕ, η καμπύλη (I) = f (VΤ) παρουσιάζει δυο ευθύγραμμα τμήματα, οι προεκτάσεις των οποίων τέμνονται σε σημείο που αντιστοιχεί στο ΙΣΟΔΥΝΑΜΟ ΣΗΜΕΙΟ της ογκομέτρησης.

Τύποι ηλεκτροδίων στις αμπερομετρικές ογκομετρήσεις Οι αμπερομετρικές ογκομετρήσεις μπορούν να γίνουν: Χρήση ενός ηλεκτροδίου εργασίας και ενός μεγάλου βοηθητικού ηλεκτροδίου Χρήση δυο δίδυμων μικροηλεκτροδίων (διαμπερομετρικές τιτλοδοτήσεις) Ηλεκτρόδιο εργασίας Βοηθητικό ηλεκτρόδιο Δίδυμα μικροηλεκτρόδια Vεφ > Υπερδυναμικό ηλεκτρενεργής ουσίας Ox + e-  Red ή Red  Ox + e- Vεφ  0.1 – 0.2 V Ox ↔ Red e-

Αμπερομετρικές ογκομετρήσεις με πολωμένο ηλεκτρόδιο Για τη γενική αντίδραση ογκομέτρησης : Ο + Τ  Π «Ο» ανάγεται «Τ» ανάγεται «Ο/Τ» ανάγονται Pb2+ SO4− Pb2+ + 2e-  Pb CrO4− + 8Η+ + 3e-  Cr3+ + 4H2O

Παράδειγμα α) Ο + e-  O´ β) T + 2e-  T´ Να σχεδιαστούν οι αναμενόμενες καμπύλες ογκομέτρησης για την αμπερομετρική ογκομέτρηση του τύπου: Ο + Τ  Π , εάν στο ηλεκτρόδιο εργασίας πραγματοποιούνται οι οι παρακάτω ημιαντιδράσεις αναγωγής: α) Ο + e-  O´ β) T + 2e-  T´ γ) O + e-  O´ και T + e-  T´ δ) O + e-  O´ και T + 2e-  T´ ε) O + 3e-  O´ και T + e-  T´

Τιτλοδότηση Η2Ο με τη μέθοδο Karl-Fischer Προσδιορισμός ιχνοποσοτήτων Η2Ο σε λάδια (βρώσιμα, μηχανών), τρόφιμα, διαλύτες, πολυμερή κ.α.. Περίπου 500.000 αναλύσεις την ημέρα διεθνώς. Ως τιτλοδότης χρησιμοποιείται το Ι2, το οποίο προστίθεται με Α) αυτόματη προχοϊδα (όταν οι ποσότητες του Η2Ο είναι μεγάλες), ~ 1 mg H2O Β) ή παράγεται ηλεκτροχημικά (οξείδωση Ι-). Χρησιμοποιείται όταν η ποσότητα του Η2Ο < 1 mg

Τιτλοδότηση Η2Ο με τη μέθοδο Karl-Fischer ΑΝΟΔΟΣ : 3Ι−  I3− + 2e- ΚΑΘΟΔΟΣ : Ι3− + 2e-  3I− Αλκοόλη (ROH: CH3OH) Βάση (Β: ιμιδαζόλιο) SO2 , I− και το ΑΓΝΩΣΤΟ ΔΕΙΓΜΑ Άνοδος παραγωγής Ι2 I2 + SO2 + 3B + ROH + H2O    2(BH)I + ROSO3BH

Σύνοψη Αμπερομετρία: Αρχή λειτουργίας, Εκλεκτικότητα, παλαίωση ΗΕ Προϋποθέσεις για ένα «σωστό πείραμα» Ηλεκτροχημικές κυψελίδες 2- και 3-ηλεκτροδίων Ποτενσιοστάτης (περιγραφή, αρχή λειτουργίας) Αμπερομετρικός βιοαισθητήρας γλυκόζης (περιγραφή, αρχή λειτουργίας) Ακινητοποίηση ενζύμων Ηλεκτρόδιο οξυγόνου Ηλεκτρόδιο Η2Ο2 Αμπερομετρικές ογκομετρήσεις Τύποι ηλεκτροδίων στις αμπερομετρικές ογκομετρήσεις Προσδιορισμός νερού με τη μέθοδο Karl-Fischer