Εργαστηριακό Κέντρο Φυσικών Επιστημών Αγίων Αναργύρων 28/02/2007 Εργαστηριακό Κέντρο Φυσικών Επιστημών Αγίων Αναργύρων 28/02/2007 Υπεύθυνος Εργ. Κέντρου : Καλλίνικος Χαρακόπουλος Επιμέλεια – Παρουσίαση : Λαμπρινή Σιαφάκα Το υλικό αυτό είναι από το σεμινάριο: «Τεχνολογίες αιχμής και η συμβολή τους στο μέλλον των Βιοεπιστημών» Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ Πρόγραμμα «ΑΝΟΙΧΤΕΣ ΘΥΡΕΣ» 18-20 Δεκεμβρίου 2006

Τί είναι οι μικροσυστοιχίες ? “Οι μικροσυστοιχίες είναι γυάλινα πλακίδια με συστοιχίες εκατοντάδων χιλιάδων ολιγονουκλεοτιδίων/ τμημάτων DNA, που αντιπροσωπεύουν γνωστά ή άγνωστα γονίδια, και στις οποίες μπορεί να υβριδοποιηθεί το DNA ή RNA προς μελέτη, αφού έχει πρώτα σημανθεί με φθορίζουσες χρωστικές”

Δύο κύριες κατηγορίες μικροσυστοιχιών Μικροσυστοιχίες DNA Μικροσυστοιχίες γονιδιακής έκφρασης Array CGH Mutation screening SNP analysis • γονιδίωμα ειδών • γονιδίωμα ιστών • γονιδίωμα ασθενειών κ.α.

Πώς φτιάχνονται/ χρησιμοποιούνται… 1. Ιχνηθέτης 2. Γυάλινη επιφάνεια 3. Τεχνικές εναπόθεσης 4. Προετοιμασία δειγμάτων 5. Υβριδοποίηση (Hybridization) 6. Detection 7. Σκανάρισμα (Scanning) 8. Ανάλυση Συνήθως εμπορικά διαθέσιμα Συνήθως πραγματοποιούνται σ’ ερευνητικά εργαστήρια

Οι ιχνηθέτες… • Καλύπτουν ~ 1cm2 στη γυάλινη επιφάνεια • Εναποτίθενται ~ 100,000s ιχνηθέτες • Τα ολιγονουκλεοτίδια εναποτίθενται ή συνθέτονται επάνω στη γυάλινη επιφάνεια • Για κάθε γονίδιο χρησιμοποιούνται 1-20 ιχνηθέτες • Κάθε ιχνηθέτης είναι συμπληρωματικός για ένα μόνο μέρος του γονιδίου • Αυστηρά κριτήρια επιλογής ιχνηθετών 3’ 5’ Εξώνια Εσώνια Περιοχές συμπληρωματικές ιχνηθετών

Η τοποθέτηση… 4 κύριες μέθοδοι: • Μικροενέσεις • Πιεσοηλεκτρικώς • Φωτολιθογραφία • Ηλεκτρικά πεδία

Προετοιμασία δείγματος (π.χ. για μικροσυστοιχίες γον. έκφρασης) Αλληλουχίες ελέγχου Φθορίζουσα χρωστική RNA cDNA cRNA Κοκτέϊλ υβριδισμού

Υβριδοποίηση Κοκτέϊλ υβριδισμού Γυάλινη πλάκα με συστοιχίες ιχνηθετών Οι συμπληρωματικές αλληλουχίες υβριδοποιούνται

Detection / Scanning Μετατρέποντας το χρώμα σε αριθμούς Βιοπληροφορική Σταθμός πλυσίματος Scanner Μετατρέποντας το χρώμα σε αριθμούς Βιοπληροφορική

Εφαρμογές Μικροσυστοιχιών DNA • SNP ανάλυση • Εντοπισμός μεταλλάξεων – Σημειακών μεταλλάξεων – Αλλαγές αριθμού αντιγράφων (gene copy number changes) • Μελέτες εξέλιξης (evolution studies)

΄Αλλα παραδείγματα … • για εντοπισμό μεταλλάξεων του καρκίνου του μαστού • για έγκαιρη διάγνωση του καρκίνου του πνεύμονα • πολλές μορφές καρκίνου υπό μελέτη • για προγεννετικό έλεγχο μεταλλάξεων του γονιδίου της κυστικής ίνωσης • για προσδιορισμό προδιάθεσης σε ψυχιατρικές ασθένειες