ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ Η Μοριακή Βιολογία, προϊόν της σύζευξης της Βιοχημείας με τη Γενετική παρέχει μια σειρά μεθόδων με ευρεία εφαρμογή σε όλες σχεδόν τις ιατρικές ειδικότητες και ιδιαίτερα στα λοιμώδη νοσήματα, τα κληρονομούμενα νοσήματα, τον καρκίνο κ.λ.π.

Ενότητες Απομόνωση DNA, RNA Ηλεκτοφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης Περιοριστικά ένζυμα Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης Κλωνοποίηση, τεχνολογία ανασυδιασμένου DNA Παραγωγή ανασυνδιασμένων πρωτεινών Εφαρμογές της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης Αλληλούχιση DNA μορίων (Sanger Sequencing) BLAST και εργαλεία στοίχισης DNA αλληλουχιών Εισαγωγή γονιδίων σε ευκαρυωτικά κύτταρα Σύνθεση cDNA μορίων Ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (qPCR, qRT-PCR) Μικροσυστοιχίες γονιδίων (Microarrays) Deep sequencing Δημιουργία διαγονιδιακών ζώων

Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR) Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης είναι μέθοδος παραγωγής μεγάλου αριθμού αντιγράφων συγκεκριμένων μικρών αλληλουχιών DNA – λογαριθμική αύξηση PCR: 1985, Βραβείο Nobel για τον Kary Mullis in 1993

Αναλώσιμα

ηλεκτροφόρηση + MgCl2 + Buffer διάλυμα + dNTPs + Taq polymerase + εκκινητές ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιείται ένα ζεύγος εκκινητών (primers) που έχουν συμπληρωματική αλληλουχία με τα άκρα του DNA στόχου

Ένας χώρος  χρήση θαλάμων βιολογικής ασφάλειας, χρήση απολυμαντικών και UV •Όχι σε χώρο καλλιεργειών μικροοργανισμών! •Χρονικός χωρισμός!

Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR) Βασίζεται στην ιδιότητα των αλυσίδων του DNA α) να αποχωρίζονται σε υψηλή θερμοκρασία και να επανενώ νονται σε χαμηλότερη θερμοκρασία και β) να αντιγράφονται Παράγονται εκατομμύρια αντιγράφων

PCR απαιτούνται: Magnesium chloride: .5-2.5mM Buffer: pH 8.3-8.8 dNTPs: 20-200µM Primers: 0.1-0.5µM DNA Polymerase: 1-2.5 units Target DNA: 1–10 μg/ml

ΕΚΚΙΝΗΤΕΣ (PRIMERS) Εκκινητές : 20-30 νουκλεοτίδια  GC = 40-6-% ομοιογενώς κατανεμημένα.

Περίπου 104 αντίγραφα DNA απαιτούνται για την ανίχνευση προϊόντος PCR μετά από 25-30 κύκλους αντίδρασης... 1–10 μg/ml DNA. … ↑ DNA + αριθμοί κύκλων ↓ ειδικότητα εκκινητή Τm  Wallace formula: Tm = 4x (#C+#G) + 2x (#A+#T) °C ΜgCl 2  απαραίτητο για την Taq polymerase!!!

Κινητική της αντίδρασης της PCR

ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΜΕΘΟΔΩΝ PCR συγκέντρωση Mg++ συγκεντρώσεις εκκινητών που επιδρούν στην ευαισθησία και ειδικότητα θερμοκρασίες πρόσδεσης –(annealing)

Βελτιστοποίηση της συγκέντρωσης MgCl2 στην PCR. •Εφαρμογή της μεθόδου χρησιμοποιώντας διαφορετικές συγκεντρώσεις MgCl2 οι οποίες κυμαίνονταν από 1 mM ως και 3mM

Βελτιστοποίηση της συγκέντρωσης των εκκινητών •Stock of primers: 100pmol/μl •Υποδιπλάσιες αραιώσεις: 50pmol/μl, 25pmol/μl, 12,5pmol/μl, 6,25pmol/μl και 3,125pmol/μl για κάθε έναν από τους εκκινητές.

Βελτιστοποίηση της συγκέντρωσης των εκκινητών Π.χ.

Βελτιστοποίηση της θερμοκρασίας για την πρόσδεση των εκκινητών •Εφαρμογή της μεθόδου σε εύρος θερμοκρασιών 42-57,5ºC Π.χ.

Κλωνοποίηση, τεχνολογία ανασυδιασμένου DNA

ΕΛΕΓΧΟΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΑΠΟΜΟΝΩΜΕΝΟΥ DNA 1/2

Cloning and selection markers Antibiotics

-Need for additional selection markers The problem of self ligation -Need for additional selection markers

Generation of engineered restriction sites on plasmids on selection markers

LacZ, Blue-white selection + INSERT

LacZ, Blue-white selection

Applications of PCR +Real time PCR Basic Research Applied Research Genotyping Genomic cloning Sequencing Detection of pathogens Pre-natal diagnosis Cancer research-Mutation detection Molecular Epidemiology +Real time PCR +cDNA synthesis and quantitative RT-PCR

Basic Research_Molecular cloning

Γονοτυπιση και Ταυτοποίηση γενομικου DNA Οι πολυμορφικές περιοχές περιέχουν αλληλοχίες μικροδορυφορικου DNA. Το μικροδορυφορικό DNA (ή short tandem repeats STR) είναι μικρές, επαναλαμβανόμενες, απλές αλληλουχίες DNA, μήκους 1-6 bp Οι πολυμορφικές περιοχές πολλαπλασιάζονται με multiplex PCR, και τα παραγόμενα κομμάτια DNA διαχωρίζονται με βάση το μεγεθός τους. Το παραγόμενο μοτίβο (pattern) λειτουργεί σαν πλαίσιο ταυτοποίησης (unique barcode) ενός ατόμου. For identification purposes, the unique pattern of DNA fragments generated by amplifying variable DNA regions is not useful by itself. The unique pattern must be compared to another pattern to determine if the patterns match. Matching patterns indicate that the two DNA samples originate from the same individual. Short tandem repeat analysis examines repetitive regions of DNA where a single, short DNA sequence is tandemly repeated multiple times. Single-nucleotide polymorphism analysis examines differences in nucleotide sequence at a single position within the DNA. STR and SNP analysis can be useful in any investigations where DNA evidence can be collected—for example, a blood stain or fingerprint from a crime scene or a bone in a missing persons investigation. DNA extracted from these samples is amplified to generate a unique set of DNA fragments. DNA is also extracted and amplified from a reference sample (blood samples taken from a suspect while in police custody or the missing person’s toothbrush or hair brush). The DNA pattern from an unknown source (e.g., DNA found at a crime scene) is compared to the DNA pattern from the reference sample. Matching patterns indicate that the sources of the DNA are identical. STR and SNP analysis can also be used to determine paternity. Since a child inherits half of his or her DNA from the father, half of the child’s DNA fragments will match those of the biological father.

Short tandem repeat

DNA FRAGMENT ANALYSIS STR1 STR2 STR3 STR4

DNA-Based Human Identification In this example, the STR loci D16S539, D7S820 and D13S317 were amplified by PCR, and the resulting DNA fragments were separated by size. The numbers to the right of the gel image indicate the number of times that the DNA sequence is repeated (5 repeats is denoted as allele 5; 10 repeats is denoted as allele 10, etc.,). Lanes marked “L” indicate the allelic ladder, which contains DNA fragments corresponding to known STR alleles (alleles 5–15 for D16S539, alleles 6–14 for D7S820 and 7–15 for D13S317) . By comparing the sizes of DNA fragments in the allelic ladder to those of an unknown sample, a scientist can determine the number of repeats in the unknown sample. If you look closely, you will see that none of the DNA patterns for samples #1–6 match. Thus, all six DNA samples originated from separate individuals, and none of the five suspects can be linked to the hair based on this DNA evidence.

DNA detection of pathogens Ανίχνευση DNA με τεράστια ευαισθησία  ανίχνευση ιών κ.α. μικροοργανισμών σε πολύ μικρές συγκεντρώσεις σε ενα βιολογικό δείγμα Το PCR μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την μοριακή ταυτοποίηση βακτηριακών Το PCR μπορεί να ανιχνεύσει γονίδια ανθεκτικότητας των βακτηρίων σε αντιβιοτικά Because of its speed and sensitivity, PCR is often the preferred method to detect DNA sequences that are not normally present in a particular sample. One example is detecting bacterial or viral DNA in human blood to aid in the diagnosis of infections and disease and help guide treatment decisions. Also, PCR can be used to detect potentially harmful organisms in our water or food supply. RT-PCR can be used to detect specific RNA sequences, such as viral RNA. PCR can be instrumental to detect specific DNA sequences when identifying and characterizing an organism. For example, the multidrug resistance (MDR) gene product confers resistance to antibiotics, and treatment of an infection differs if the organism is MDR+ or MDR–. PCR is often used to characterize an infectious agent and its virulence factors to guide the course of treatment.

PRC diagnostics Viruses Bacteria Analysis for resistant genes RT-PCR can detect specific RNA sequences within a sample. Example: Retroviruses have an RNA genome. Retroviral RNA can be detected by RT-PCR to diagnose retroviral infections. Viruses HIV, SARS, H5N1 Bacteria meningococcus, legionellosis Analysis for resistant genes MRSA, VRE

Detection Of Pathogens Molecular Identification: Detection Of Pathogens Sensitivity of detection of PCR-amplified M. tuberculosis DNA. (Kaul et al.1994)

Mutation detection

Genomic PCR amplification Sanger Sequencing

Sanger sequencing

PCR_ΠΡΟΓΕΝΝΗΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ

cDNA synthesis

RECOMBINANT PROTEINS

Production of recombinant Insulin

pET System T7 RNA Polymerase is an RNA polymerase from the T7 bacteriophage that catalyzes the formation of RNA in the 5'→ 3' direction.