Έφη Πετεινάκη Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Θεσσαλίας 7η Ημερίδα Κλινικής Μικροβιολογίας, Αθήνα 20 Ιανουαρίου 2007 Θέμα: Το Αντιβιόγραμμα στην Καθημερινή Εργαστηριακή Πρακτική Κύριοι φαινότυποι μικροβιακής αντοχής και η ερμηνεία τους: Εντερόκοκκοι-Στρεπτόκοκκοι Έφη Πετεινάκη Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Θεσσαλίας

Ανάγνωση-Ερμηνεία Αντιβιογράμματος Βασικές αρχές Γνώση της εγγενούς αντοχής του συγκεκριμένου μικροοργανισμού σε κάποια αντιμικροβιακά φάρμακα (π.χ. εντερόκοκκοι-κεφαλοσπορίνες) Σωστή ταυτοποίηση σε επίπεδο είδους (π.χ. εντερόκοκκοι και γλυκοπεπτίδια)

Εντερόκοκκοι Gram-θετικοί κόκκοι , καταλάση-αρνητικοί, διάταξη σε ζεύγη ή κοντές αλυσίδες, θετικό το αντιγόνο D κατά Lancefield ανθεκτικοί σε δυσμενή περιβάλλοντα-δυνατότητα διασποράς ενδογενή αντοχή σε οξακιλλίνη, κεφαλοσπορίνες, ερταπενέμη, πεφλοξασίνη, κλινταμυκίνη σε αμινογλυκοσίδες και κινολόνες ( αντοχή χαμηλού επιπέδου) ο συνδυασμός τριμεθοπρίμης-σουλφομεθοξαζόλης δεν είναι αποτελεσματικός θεραπευτικά σε εντεροκοκκικές λοιμώξεις

ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΦΥΣΙΚΗΣ ΑΝΤΟΧΗΣ ΤΩΝ ΕΝΤΕΡΟΚΟΚΚΩΝ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΦΥΣΙΚΗΣ ΑΝΤΟΧΗΣ ΤΩΝ ΕΝΤΕΡΟΚΟΚΚΩΝ Κεφαλοσπορίνες (χαμηλή συγγένεια με PBP5) Αμινογλυκοσίδες-χαμηλής συγκέντρωσης (κυτταρικό τοίχωμα) (συν-χορήγηση με β-λακταμικό αντιβιοτικό) Φλουοροκινολόνες (χαμηλού επιπέδου αντοχή, χαμηλή συγγένεια με DNA-γυράση, γονίδιο qnr) Λινκοσαμίδες- Στρεπτογγραμίνη Α (μηχανισμός αντλίας, LSA φαινότυπος ) (εξαιρείται ο E. faecium) Τριμεθοπρίμη-σουλφομεθοξαζόλη (φυλλικό οξύ από εξωκυττάρια πηγή)

Quinupristin-Dalfopristin (15 μg) (μόνο για Ε. faecium) Χημειοθεραπευτικά Ομάς Α: Έλεγχος-Αναφορά Penicillin (10 units) Ampicillin (10 μg) Ομάς Β: Έλεγχος-Επιλεκτική Αναφορά Vancomycin (30 μg) Teicoplanin (30 μg) Gentamycin (120 μg) Streptomycin (300 μg) Linezolid (30 μg) Tetracycline (30 μg) Erythromycin (15 μg) Rifampin (5 μg) VRE Chloramphenicol (30 μg) Quinupristin-Dalfopristin (15 μg) (μόνο για Ε. faecium) Ομάς O: Έλεγχος σε ούρα Ciprofloxacin (5 μg) Levofloxacin (5 μg) Norfloxacin (10 μg) Gatifloxacin (5 μg) Nitrofurantoin (300 μg) Υλικό: Mueller Hinton agar Βακτηριακό εναιώρημα: ισοδύναμο του 0,5 της κλίμακας McFarland (1.50X108 cfu/ml). Ενοφθαλμισμός: άμεσος Επώαση: 350C για 16-18 ώρες; 24 ώρες για τον έλεγχο της βανκομυκίνης Πρότυπο στέλεχος: S. aureus ATCC25923 CLSI 2006

Επίκτητη αντοχή των εντεροκόκκων Αναπτύσσουν επίκτητη αντοχή  μεταφορά γονιδίων αντοχής  μέσω πλασμιδίων, μεταθετών στοιχείων, ή μεταλλάξεων Eπίκτητη αντοχή σε β-λακταμικά Επίκτητη αντοχή σε γλυκοπεπτίδια Επίκτητη αντοχή σε αμινογλυκοσίδες (συνδυασμός με β-λακταμικά και γλυκοπεπτίδια) Επίκτητη αντοχή σε λινεζολίδη

Εντερόκοκκοι και β-λακτάμες PBPF, PonA, PBPZ, PBP5, PBPA, PBPB Φυσική αντοχή σε κεφαλοσπορίνες, οξασιλλίνη και μονοβακτάμες - χαμηλή συγγένεια με την PBP5 Μηχανισμοί επίκτητης αντοχής (E. faecium) 1. Ποσοτική αύξηση της PBP5 (Ε. faecium, MICAM: 8-16 mg/L) PBPs 2. Τροποποιημένη συγγένεια της PBP5 (Met485Ala + Ser466 ) (ΜΙCAM>16mg/L) Παραγωγή πενικιλλινάσης (Αργεντινή, Λίβανο, ΗΠΑ) (ΜΙCAM 2-4mg/L)/ (ΜΙCPEN 4-8mg/L) Coudron et al; Antimicrob Agents Chempther 40:2420-22 Murray et al; Antimicrob Agents Chemother 36:2355-59 Patterson et al; Antimicrob Agents Chemother 32:122-124

Σχόλια Ευαισθησία σε αμπικιλλίνη σημαίνει ευαισθησία σε αμοξυκιλλίνη, αμοξυκιλλίνη+κλαβουλανικό, αμπικιλλίνη-σουλβακτάμη, πιπερασιλλίνη και πιπερασιλλίνη-ταζομπακτάμη. Αντιβιοτικό-δείκτης για αντοχή σε β-λακτάμες είναι η αμπικιλλίνη (στελέχη πενικιλλίνη R-αμπικιλλίνη S) Αντοχή σε αμπικιλλίνη E. faecium ( συνήθως) ιμιπενέμη Σε στελέχη που απομονώνονται από αίμα ή ΕΝΥ είναι απαραίτητος ο έλεγχος για παρουσία πενικιλλινάσης χρησιμοποιώντας δίσκο νιτροκεφίνης ( υψηλό μικροβιακό εναιώρημα)

Επιδημιολογικά δεδομένα Θεσσαλία : E. faecalis E. faecium 218 89 AMP- S 218 18 AMP- R 0 71 (80%) IMP- R 0 85 (95.5%) pen/ase 0 0

ΕΝΤΕΡΟΚΟΚΚΟΙ και ΓΛΥΚΟΠΕΠΤΙΔΙΑ 1988 VRE vanA, van B, vanD, vanC, vanE, vanG γονίδια D-Ala-D-Lys D-Ala-D-Ser

ΔΡΑΣΗ ΒΑΝΚΟΜΥΚΙΝΗΣ

ΑΝΤΟΧΗ ΕΝΤΕΡΟΚΟΚΚΩΝ ΣΤΗ ΒΑΝΚΟΜΥΚΙΝΗ ΑΝΤΟΧΗ ΕΝΤΕΡΟΚΟΚΚΩΝ ΣΤΗ ΒΑΝΚΟΜΥΚΙΝΗ 

Enterococcus spp Φαινότυποι αντοχής στα γλυκοπεπτίδια Van-A φαινότυπος (πλασμίδιο) Vancomycin R, Teicoplanin R Van-B φαινότυπος (χρωμόσωμα) Vancomycin R, Teicoplanin S  Van-D φαινότυπος (χρωμόσωμα) Vancomycin R, Teicoplanin S Van-G, Van-E & Van-C φαινότυπος (χρωμόσωμα) Vancomycin LR/S, Teicoplanin S

E. casseliflavus, E. gallinarum, Ενδογενή αντοχή σε γλυκοπεπτίδια Vancomycin LR/S, Teicoplanin S Παρουσία του Van-C γονιδίου (species-specific gene) (χρωμόσωμα) Αντοχή σε γλυκοπεπτίδια Απαραίτητη προυπόθεση η σωστή ταυτοποίηση σε επίπεδο είδους umum

Εντερόκοκκοι και αμινογλυκοσίδες Μηχανισμός επίκτητης αντοχής Ενζυματική αδρανοποίηση (AAC, APH, ANT*) Streptomycin (300 μg), Gentamιcin (120 μg) Συν-χορήγηση με αντιβιοτικό που δρά στο κυτταρικό τοίχωμα (β-λακτάμες, γλυκοπεπτίδια) AAC: aminoside N-acetyltransferase ANT: aminoside O-nucleotidyltranserase APH : aminoside O-phosphotranserase

Τροποποιητικά ένζυμα ‘Ενζυμο ΑΝΤ(6)-Ι Γονίδιο ant(6)Ia Φαινότυπος SM ΑPH(3’)-III aph(3’)IIIa Kan, NET,AN AAC(6’)-APH(2’’)-I aac(6’)Ie KAN, GM, NN AAC(6’)-I APH(2’’)-I aac(6’)Ii aph(2’’)Ic Kan, NN Kan, GM, NN

ΑΝΑΣΤΟΛΗ ΠΡΩΤΕΙΝΟΣΥΝΘΕΣΗΣ (50S) ΟΞΑΖΟΛΙΔΙΝΟΝΕΣ ΔΡΑΣΗ ΑΝΑΣΤΟΛΗ ΠΡΩΤΕΙΝΟΣΥΝΘΕΣΗΣ (50S) ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΟ ΦΑΣΜΑ (VRE)

Μηχανισμός δράσης

ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΔΡΑΣΗΣ Σύνδεση στην 70S υποομάδα του ριβοσώματος περιοχή σύνδεσης περιοχή V του 23S rRNA γονιδίου ΕΝΤΕΡΟΚΟΚΚΟΙ: 4-6 αντίγραφα της περιοχής V

ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣΑΝΤΟΧΗΣ Αλλαγή στόχου δράσης G2576T (κλινική σημασία) ΔΙΑΡΚΕΙΑ ΤΗΣ ΘΕΡΑΠΕΙΑΣ

ΑΝΤΟΧΗ ΚΑΤΑ ΤΗ ΔΙΑΡΚΕΙΑ ΤΗΣ ΘΕΡΑΠΕΙΑΣ σταδιακή αλλαγή λόγω μετάλλαξης των θέσεων σύνδεσης (1 6) συσχέτιση χρόνου θεραπείας και αριθμού μεταλλάξεων συσχέτιση αριθμού μεταλλάξεων και τιμή ΜΙC

LINEZOLID MIC (mg/L) No of mutated genes 2 0/6 8 1/6 16 1/6 32 2/6 32 3/6 64 4/6 64 5/6 128 6/6

Ευαισθησία: ≤2 mg/L, Αντοχή ≥8 mg/L Κριτήρια NCCLS Enterococci Ευαισθησία: ≤2 mg/L, Αντοχή ≥8 mg/L 1*-2* /6 επηρεάζουν ελάχιστα την ΜΙC (4-8 mg/L) χαρακτηρίζονται ΟΡΘΑ ως ΕΥΑΙΣΘΗΤΑ ΑΠΟΤΥΧΙΑΤΗΣ ΘΕΡΑΠΕΙΑΣ

‘Eλεγχος αντοχής σε λινεζολίδη Παρατεταμένη επώαση του αντιβιογράμματος ιδιαίτερα στα στελέχη που απομονώνονται από ασθενείς που βρίσκονται υπό θεραπεία με λινεζολίδη E-test (δεύτερο 24ωρο) Κ/α κοπράνων μετά το τέλος της θεραπείας με λινεζολίδη (κίνδυνος αποικισμού-διασπορά-λοίμωξη) Pratti et al; Int J Antimicrob Agents 2007 Mitsogiannis et al; Scand J Infect Dis 2007 ου

Αντιβιόγραμμα λινεζολίδης

Στρεπτόκοκκοι Ανάγνωση αντιβιογράμματος Αιμόλυση-μέγεθος αποικίας β-αιμολυτικοί ομάδας Α, B, C και G μεγάλου μεγέθους αποικία A. β-αιμολυτικοί ομάδας Α, C, F και G μικρού μεγέθους αποικία B. viridans group (S. mitis, S. oralis, S. sanguis, S. salivarius, S. intermedius, S. consellatus, S. mutans, S. bovis

Στρεπτόκοκοι-Φυσική αντοχή Χαμηλού επιπέδου αντοχή σε αμινογλυκοσίδες (απαραίτητος ο έλεγχος με δίσκους υψηλής συγκέντρωσης)

Συνθήκες αντιβιογράμματος Χημειοθεραπευτικά Ομάς Α: Έλεγχος-Αναφορά Penicillin (10 units) Ampicillin (10 μg) Erythromycin (15 μg) Clindamycin (2 μg) Lincomycin (15 μg) Ομάς Β: Έλεγχος-Επιλεκτική Αναφορά Cefepime (30 μg) ή Cefotaxime (30 μg) Ceftriaxone (30 μg) Vancomycin (30 μg) Teicoplanin (30μg) Levofloxacin (5 μg) Ofloxacin (5 μg) Gatifloxacin (5 μg) Tetracycline (30 μg) Linezolid (30 μg) Quinupristin-dalfopristin (15 μg) Chloramphenicol (30 μg) Συνθήκες αντιβιογράμματος Υλικό: Mueller Hinton agar με 5% αίμα προβάτου Βακτηριακό εναιώρημα: ισοδύναμο του 0,5 της κλίμακας McFarland (1.50X108 cfu/ml). Ενοφθαλμισμός: άμεσος Επώαση: 350C για 20-24 ώρες, παρουσία 5% CO2 Πρότυπο στέλεχος: S. pneumoniae ATCC 49619

β-λακταμικά και Στρεπτόκοκκοι Γενικά σχόλια Ο S. pyogenes όσο και ο S. agalactiae είναι ευαίσθητοι στην πενικιλλίνη και σε όλα τα διαθέσιμα β-λακταμικά αντιβιοτικά. Ευαισθησία σε πενικιλλίνη σημαίνει ευαισθησία σε αμπικιλλίνη, αμοξυκιλλίνη, αμοξυκιλλίνη-κλαβουλανικό, αμπικιλλίνη-σουλβακτάμη, κεφακλόρ, κεφαζολίνη, κεφεπίμη, κεφπροζίλη, κεφοταξίμη , κεφτριαξόνη, κεφουροξίμη κλπ. Όλοι οι πρασινίζοντες στρεπτόκοκκοι που απομονώνονται από περιοχές στείρες μικροβίων πρέπει να ελέγχονται για την ευαισθησία τους στην πενικιλλίνη με προσδιορισμό της ελάχιστης ανασταλτικής πυκνότητας.

ΜLSB και Στρεπτόκοκκοι Γενικά σχόλια αναστολή πρωτεινοσύνθεσης σύνδεση στο 23S rRNA (περιοχή V) Α2058, A2059, A2062, G2505, U2609 μακρολίδες (14-, 15-, 16 μερή) λινκοσαμίδες (λινκομυκίνη, κλινταμυκίνη) στρεπτογραμίνη Β 14-μελείς: erythromycin, clarithromycin, dirithromycin,roxithromycine 15-μελείς:azithromycin 16-μελείς:josamycine, miokamycine, midecamycine, rokitamycine, spiramycine, tylosine RN

Μηχανισμοί αντοχής σε μακρολίδες Τροποποίηση στόχου δράσης α. μεθυλίωση της αδενίνης στην 2058 θέση (erm) MLSB φαινότυπος μακρολίδες λινκοσαμίδες κοινή σύνδεση στρεπτογραμίνη Β β. μεταλλάξεις μακρολίδες Μηχανισμός αντλίας (mef) 14-15 μελείς μακρολίδες Μ-φαινότυπος όχι telithromycin

Φαινότυποι αντοχής ΜLSΒ συστασιακού τύπου: αντοχή ερυθρομυκίνη, κλινταμυκίνη ΜLSΒ επαγώγιμου τύπου: αντοχή ερυθρομυκίνη, ευαισθησία κλινταμυκίνη Μ - φαινότυπος : αντοχή ερυθρομυκίνη, ευαισθησία κλινταμυκίνη

ΔΙΑΚΡΙΣΗ ΦΑΙΝΟΤΎΠΩΝ ΜLSBΕΠΑΓΩΓΙΜΟΥ ΤΥΠΟΥ ΚΑΙ Μ Μεθυλάση, μεθυλίωση αδενίνης, αλλαγή ριβοσωματικού στόχου, μη σύνδεση του αντιβιοτικού, αντοχή Επαγώγιμος-μη παραγωγή μεθυλάσης απουσία επαγωγέα Επαγωγείς (14-15 μελείς μακρολίδες) Δοκιμασία διπλών δίσκων (ερυθρομυκίνη, κλινταμυκίνη) 14-μελείς: erythromycin, clarithromycin, dirithromycin,roxithromycine 15-μελείς:azithromycin 16-μελείς:josamycine, miokamycine, midecamycine, rokitamycine, spiramycine, tylosine

ΜLSB –φαινότυπος Συστασιακός (αντοχή ερυθρομυκίνη) (αντοχή λινκοσαμίδες) καμία μετατροπή στην ανάγνωση Επαγώγιμος (αντοχή ερυθρομυκίνη) (ευαισθησία σε λινκοσαμίδες) μετατροπή στην ανάγνωση (CLSI)

Στρεπτόκοκκοι και Μακρολίδες Απάντηση στον κλινικό ιατρό M-φαινότυπος: aντοχή σε 14-και 15 μελείς μακρολίδες (εξαιρείται η telithromycin) ευαισθησία σε 16-μερείς, λινκοσαμίδες ΜLSB –φαινότυπος : αντοχή σε μακρολίδες και λινκοσαμίδες Σχόλιο για τις λινκοσαμίδες σε περίπτωση επαγώγιμου τύπου -ε

Σπουδαιότητα των λινκοσαμιδών στην κλινική θεραπευτική σε ασθενείς με διεισδυτικές λοιμώξεις από S. pyogenes σε ασθενείς με αλλεργία σε πενικιλλίνη πριν τον τοκετό σε γυναίκες που είναι αποικισμένες με S. agalactiae

Λινκοσαμίδες και Στρεπτόκοκκοι Μηχανισμός αντλίας (LSA,S. agalactiae) Φαινότυπος: ζώνη αναστολής στην κλινταμυκίνη (δεν επηρεάζεται η λινκομυκίνη) Υδρολυτικά ένζυμα (lnuC, κλπ) Φαινότυπος: ζώνη αναστολής στην λινκομυκίνη (δεν επηρεάζεται η κλινταμυκίνη) Πάντα έλεγχος με δίσκο ερυθρομυκίνης Πάντα σύγκριση με ζώνη αναστολής σε ερυθρομυκίνη :

LSA-phenotype

Streptococcus agalactiae lnuC (+)

Streptococcus uberis linnew

Σχόλια-Ανάγνωση του αντιβιογράμματος Απάντηση στον κλινικό : Αντοχή σε λινκοσαμίδες Έλεγχος της λινκομυκίνης και κλινταμυκίνης στο αντιβιόγραμμα Αδυναμία ανίχνευσης μόνο με δίσκο κλινταμυκίνης ή λινκομυκίνης / κίνδυνος θεραπευτικής αποτυχίας

Gots-test ανίχνευση τροποποιητικών ενζύμων

ερμηνεία της αντοχής α. αξιόπιστη ταυτοποίηση του μικροοργανισμού β. γνώση της φυσικής αντοχής του μικροοργανισμού γ. αντοχή σε μεμονωμένο αντιβιοτικό (π.χ.ερυθρομυκίνη) δ. αντοχή σε συνδυασμούς αντιβιοτικών (π.χ.ερυθρομυκίνη-κλινταμυκίνη) ε. γνώση της επιδημιολογίας της αντοχής της περιοχής μας ντο

Eυχαριστίες Στις Διευθύντριες των Nοσοκομείων κ.κ. E. Μαλάμου, κ. Κούτσια-Καρούζου, κ. A. Πάγκαλη, κ. Δ. Μπακόλα, κ. Ε. Βλαχάκη, κ. Λ. Ζέρβα, στην Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Μικροβιολογίας κ. Ι. Σπηλιοπούλου και στον Καθηγητή Α. Ν. Μανιάτη Στους συναδέλφους κ. Ε. Αλεξάνδρου, κ. Ε. Βαγιάκου, κ. Ν. Σιαφάκα, κ. Μ. Βέργη, Α. Πραττή Στους στενούς συνεργάτες μου Μ. Καρανίκα, Δ. Κλάψα, Μ. Μοράβα Στον Καθηγητή R. Leclercq, M. Auzou και σε όλα τα μέλη της ερευνητικής ομάδας του τμήματος μικροβιολογίας της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου της Caen