ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΑΝΟΙΚΤΑ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΑ ΜΑΘΗΜΑΤΑ Εφαρμοσμένη Γενετική Γονιδιωματική Διδάσκουσα: Επίκουρη Καθηγήτρια Αμαλία-Σοφία Αφένδρα

Άδειες Χρήσης Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό υπόκειται σε άδειες χρήσης Creative Commons. Για εκπαιδευτικό υλικό, όπως εικόνες, που υπόκειται σε άλλου τύπου άδειας χρήσης, η άδεια χρήσης αναφέρεται ρητώς.

Γονιδιωματική Η ανάπτυξη και η εφαρμογή νέων διαδικασιών χαρτογράφησης. προσδιορισμού αλληλουχίας. υπολογισμού. για την ανάλυση ολόκληρου του γονιδιώματος των οργανισμών.

Η γονιδιωματική περιλαμβάνει τρία πεδία: 1. Δομική γονιδιωματική γενετική χαρτογράφηση. φυσική χαρτογράφηση. προσδιορισμός αλληλουχίας ολόκληρων γονιδιωμάτων. 2. Λειτουργική γονιδιωματική Η λεπτομερής ανάλυση της λειτουργίας των γονιδιακών και μη γονιδιακών αλληλουχιών σε ολόκληρα γονιδιώματα. 3. Συγκριτική γονιδιωματική Η σύγκριση ολόκληρων γονιδιωμάτων από διαφορετικά είδη, με στόχο την κατανόηση των λειτουργιών του κάθε γονιδιώματος, αλλά και τις εξελικτικές τους σχέσεις.

Προσεγγίσεις για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας του γονιδιώματος Α Δημιουργία γενετικών και φυσικών χαρτών υψηλής ανάλυσης του γονιδιώματος. Μεθοδικός προσδιορισμός αλληλουχίας. Β: Τυφλή στόχευση Πέψη του γονιδιώματος σε τυχαία αλληλεπικαλυπτόμενα τμήματα. Προσδιορισμός της αλληλουχίας των τμημάτων. Συναρμολόγηση των αλληλουχημένων τμημάτων με τη βοήθεια υπολογιστικών αλγορίθμων.

Πλήρης νουκλεοτιδικός χάρτης από: Γονιδιώματα πολλών ιών. Γονιδιώματα πολλών προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών οργανισμών. Επιβεβαίωση του διαχωρισμού των ζώντων οργανισμών σε: Βακτήρια. Αρχαία. Ευκάρυα.  

Τάση των γονιδιωμάτων: Αυξανόμενη ποσότητα DNA αυξανόμενη πολυπλοκότητα του οργανισμού (σχέση όχι πάντα πλήρως ανάλογη) Βακτήρια, Αρχαία: Γονίδια καλύπτουν το μεγαλύτερο τμήμα των γονιδιωμάτων. Ευκάρυα Μεγάλο εύρος στην περιεκτικότητα γονιδίων Τάση: μειωμένη περιεκτικότητα σε γονίδια μεγαλύτερη πολυπλοκότητα.

Λειτουργική γονιδιωματική Μελέτη γονιδιωμάτων Καθορισμός των λειτουργιών όλων των γονιδίων. Καθορισμός των προτύπων ελέγχου της γονιδιακής έκφρασης. Η γονιδιακή έκφραση αναλύεται σε δύο επίπεδα: όλων των μεταγράφων mRNA ⇨ μεταγράφωμα. όλων των πρωτεϊνών ⇨ πρωτέωμα.

1981: Αλληλουχία του πρώτου ολόκληρου γονιδιώματος: το κυκλικό γονιδίωμα του ανθρώπινου μιτοχονδρίου (16.159 bp). 1986: πρόταση για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας ολόκληρου του ανθρώπινου γονιδιώματος Human Genome Project (HGP) Έναρξη της διαδικασίας: 1990. http://www.ornl.gov/TechResources/Human_Genome/home.html Αποτελείται από το Human Genome Program των: Department of Energy, DOE. Νational Institute of Health (NIH). National Human Genome Research Institute (NHGRI: http://www.genome.gov).

Παράλληλες μελέτες προσδιορισμού της αλληλουχίας γονιδιωμάτων άλλων σημαντικών οργανισμών που χρησιμοποιούνται σε μελέτες γενετικής για συγκριτικούς λόγους (μέρος του HGP). Escherichia coli Εκπρόσωπος προκαρυωτικών οργανισμών. Saccharomyces cerevisiae Εκπρόσωπος μονοκύτταρων ευκαρυωτικών οργανισμών. Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans Εκπρόσωποι πολυκύτταρων ζώων γονιδιώματος μέτριας πολυπλοκότητας. Mus musculus Εκπρόσωπος θηλαστικών με γονιδίωμα πολυπλοκότητας ανάλογης του ανθρώπου.

Στόχοι του HGP: Αναγνώριση όλων των γονιδίων στο ανθρώπινο DNA. Προσδιορισμός της αλληλουχίας των 3 δισεκατομμυρίων χημικών ζευγών βάσεων που αποτελούν το DNA. Αποθήκευση των πληροφοριών σε δημόσιες βάσεις δεδομένων. Ανάπτυξη εργαλείων για την ανάλυση δεδομένων. Μεταφορά παρόμοιων τεχνολογιών στον ιδιωτικό τομέα. Προσδιορισμός των ηθικών, νομικών και κοινωνικών θεμάτων (ELSI, Εthical, Legal Social Issues,) που ίσως προκύψουν από αυτή την έρευνα.

Προώθηση της μεταφοράς τεχνολογίας και πληροφοριών σε όλους τους ερευνητές (& ιδιωτικό τομέα) ανάπτυξη νέων ιατρικών εφαρμογών. ανάπτυξη νέων βιοτεχνολογικών προϊόντων. National Science Foundation: χρηματοδότηση από την αμερικανική πλευρά για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας του Arabidopsis thaliana. Άλλες χώρες (Μ. Βρετανία, Γαλλία & Ιαπωνία): παρόμοια προγράμματα γονιδιωματικής. Οργάνωση του Ανθρώπινου Γονιδιώματος (Ηuman Genome Organisation, HUGO). Ιδιωτικές εταιρείες.

Το αντικείμενο αυτού του κεφαλαίου είναι: η ανασκόπηση του αντικειμένου. η εισαγωγή στις πληροφορίες που αποκτήθηκαν από την ανάλυση της αλληλουχίας του γονιδιώματος. Εστίαση στην αλληλουχία του ανθρώπινου γονιδιώματος Πληροφορίες για τις αλληλουχίες γονιδιωμάτων άλλων οργανισμών.

1999, 2000: παρουσιάστηκαν οι αλληλουχίες πέντε διαφορετικών ανθρώπινων χρωμοσωμάτων. 6/2000: κοινή ανακοίνωση (Francis Collins, HGP & J. Craig Venter, Celera Genomics) για την ολοκλήρωση προσχέδιου εργασίας 3,1 δις νουκλεοτιδίων του ανθρώπινου γονιδιώματος. 14 Απριλίου 2003: επιτυχής ολοκλήρωση όλων των στόχων του HGP  τελική αλληλουχία του ανθρώπινου γονιδιώματος σε μεγάλο βαθμό ακριβής και συνεχής, με κενά μόνο σε τμήματα όπου οι αλληλουχίες δεν μπορούν να καθοριστούν με την σημερινή τεχνολογία. Kαλύπτει περίπου το 99 τοις εκατό των περιοχών του γονιδιώματος που περιέχουν γονίδια, με ακρίβεια 99.99 τοις εκατό.

Δομική γονιδιωματική Δύο γενικές προσεγγίσεις: Χαρτογράφηση Κατασκευή γενετικών και φυσικών χαρτών αυξημένης ανάλυσης σε τμήματα του γονιδιώματος Κατόπιν, προσδιορισμός της αλληλουχίας τους. Τυχαία στόχευση ολόκληρου του γονιδιώματος (WGS, Whole-Genome Shotgun) «Κατακερματισμός» ολόκληρου του γονιδιώματος σε τυχαία, αλληλοεπικαλυπτόμενα τμήματα στα οποία προσδιορίζεται η αλληλουχία. Συναρμολόγηση μέσω υπολογιστή με βάση τις αλληλεπικαλύψεις μεταξύ των τμημάτων. Σε αυτήν την προσέγγιση, δεν είναι γνωστό από πριν πού εντοπίζεται κάθε τμήμα.

Προσδιορισμός νουκλεοτιδικής αλληλουχίας: Μέθοδος Sanger O C N purine or pyrimidine P OH HO H chain termination method

*

Τι είναι η χαρτογράφηση Δημιουργία γενετικών & φυσικών χαρτών. Αρχικός στόχος: εντοπισμός γενετικών δεικτών που βρίσκονται σχετικά κοντά μεταξύ τους στο γονιδίωμα. Επιλεγμένα παραδείγματα πειραμάτων γενετικής και φυσικής χαρτογράφησης, ώστε να αντιληφθούμε τον τρόπο σκέψης και τη λογική που χρησιμοποιήθηκε. Στο HGP συγκεντρώθηκαν και αναλύθηκαν δεδομένα γενετικής και φυσικής χαρτογράφησης από περισσότερα του ενός τύπου πειράματα.

Γενετική χαρτογράφηση ενός γονιδιώματος Ένας από τους στόχους του HGP: δημιουργία ενός γενετικού χάρτη υψηλής πυκνότητας (τουλάχιστον ένα γενετικό δείκτη ανά 1 Mb γονιδιώματος - περίπου μία μονάδα χάρτη). Γενετικοί χάρτες γονιδιωμάτων: γενετικές διασταυρώσεις και (για τον άνθρωπο) γενεαλογική ανάλυση (γενετική χαρτογράφηση).

Γενετική χαρτογράφηση ενός γονιδιώματος Χαρτογράφηση των γονιδίων του ανθρώπου Γενετικές διασταυρώσεις: Επαλήθευση των θέσεων των γενετικών δεικτών στα χρωμοσώματα (αλληλόμορφα τα οποία μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να σημειωθεί μια θέση πάνω στο χρωμόσωμα). Καθορισμός της γενετικής απόστασης μεταξύ τους.

Γενετική χαρτογράφηση ενός γονιδιώματος Γενετική απόσταση: συχνότητα των ανασυνδυασμών μεταξύ των δεικτών γονιδιακοί δείκτες δείκτες DNA χρησιμοποιούνται για πειράματα γενετικής χαρτογράφησης. Ανθρώπινο γονιδίωμα: 24 χάρτες 22 αυτοσωμικά χρωμοσώματα. χρωμόσωμα Χ . χρωμόσωμα Y.

Δημιουργία ενός γενετικού χάρτη για δύο γονίδια: η απλούστερη ανάλυση γενετικής χαρτογράφησης. ΑΛΛΑ: Κατασκευή ενός γενετικού χάρτη με πληροφορίες για δύο γονίδια: όχι αποτελεσματική για ένα πολύ μεγάλο γονιδίωμα Η συναρμολόγηση των γενετικών χαρτών είναι αρκετά χρονοβόρα (ακόμη και με πολλούς γενετικούς τόπους διαθέσιμους). Για τον άνθρωπο, δεν υπάρχουν αρκετά γνωστά γονίδια τα οποία να δίνουν χρωμοσωμικούς χάρτες με κοντινά παρατεταγμένα γονίδια. Η γενετική χαρτογράφηση έχει περάσει σε άλλο επίπεδο: μεγάλος αριθμός πολυμορφικών δεικτών DNA. ανάπτυξη μοριακών εργαλείων για την γρήγορη αποτύπωσή τους.

HGP (πρόγραμμα ανθρώπινου γονιδιώματος) δείκτης DNA που χρησιμοποιήθηκε για την γενετική χαρτογράφηση: αλληλουχία-ετικέτα θέσης (STS, Sequence-Tagged Site) ( Ή: θέση αλληλουχίας-ετικέτας) STS: αλληλουχία DNA μοναδική στο γονιδίωμα. Μικρό τμήμα DNA γνωστής αλληλουχίας που καθορίζει μία μοναδική θέση στο ανθρώπινο γονιδίωμα. Τυπικά: δύο αλληλουχίες μερικών εκατοντάδων bp. ενισχύονται με PCR από εκκινητές που σχεδιάζονται με βάση καθορισμένες αλληλουχίες του DNA ώστε να επιτρέπουν τον ειδικό πολλαπλασιασμό μερικής ή όλης της αλληλουχίας.

Η γονιδιωματική θέση για την αλληλουχία υπό αναζήτηση θεωρείται πως είναι σημασμένη, λόγω της ικανότητας της να αναλυθεί για αυτήν την αλληλουχία. Καλύτερη πηγή δεικτών DNA για την δημιουργία γενετικών χαρτών από STS: οι πολυμορφικές STR (short tandem repeats, βραχείες διαδοχικές επαναλήψεις). Αυτοί ήταν οι δείκτες που χρησιμοποιήθηκαν στην κατασκευή του γενετικού χάρτη υψηλής πυκνότητας του ανθρώπινου γονιδιώματος.

Πολυμορφισμοί DNA Μία ή περισσότερες εναλλακτικές μορφές (αλληλόμορφα) ενός χρωμοσωμικού τόπου τα οποία: ή διαφέρουν στη νουκλεοτιδική αλληλουχία. ή περιέχουν μεταβλητό αριθμό διαδοχικά επαναλαμβανόμενων νουκλεοτιδικών μονάδων. Χρήσιμοι στις μελέτες της γενετικής χαρτογράφησης Δείκτες DNA. Χρήσιμα εργαλεία στην κατασκευή γενετικών χαρτών υψηλής πυκνότητας. Συχνότητα πολυμορφισμών DNA στο ανθρώπινο γονιδίωμα: 1 ανά 350 bp. Ανθρώπινο γονιδίωμα: 3  109 bp Άρα: περίπου 9 εκατ. πολυμορφισμοί μεταξύ δύο απλοειδών γονιδιωμάτων.

Κατηγορίες πολυμορφισμών DNA SNPs (single nucleotide polymorphisms) Πολυμορφισμοί ενός νουκλεοτιδίου. STRs (short tandem repeats) βραχείες διαδοχικές επαναλήψεις. VNTRs (variable number of tandem repeats) μεταβλητός αριθμός διαδοχικών επαναλήψεων.

STRs (short tandem repeats) Διαφορετική αναλογία ζευγών GC από το υπόλοιπο DNA (διαχωρισμός με υπερφυγοκέντρηση σε κλίση πυκνότητας CsCl) δορυφορικές ζώνες  δορυφορικό DNA (satellite DNA) Εξειδικευμένο κατά είδος οργανισμών Περιέχει και DNA άλλων διαδοχικά επαναλαμβανόμενων περιοχών εκτός των κεντρομερών Χωρίζεται σε υποομάδες μινι-δορυφορικών και μικρο-δορυφορικών αλληλουχιών Έχουν αποδειχθεί εξαιρετικά χρήσιμες στην ανάλυση γονιδιωμάτων και σε μελέτες μοριακής τυποποίησης.

STRs (short tandem repeats) Αλληλουχίες DNA μήκους 2 – 6 bp Επανάληψη από λίγες έως περίπου 100 φορές (π.χ. GT, CAG). Ανθρώπινο γονιδίωμα: 128.000 δινουκλεοτιδικά STR. 8.740 τρινουκλεοτιδικά STR. 23.680 τετρανουκλεοτιδικά STR. 4.300 πεντανουκλεοτιδικά STR. 230 εξανουκλεοτιδικά STR (π.χ. τελομερή).

Γονοτύπηση με PCR ενός γενετικού τόπου STR Απομόνωση γονιδιωματικού DNA PCR με εκκινητές που περιβάλλουν το STR Προϊόντα PCR: ταυτοποίηση με ηλεκτροφόρηση Στην εικόνα: αλληλόμορφο STR 1  6 επαναλήψεις GATA. αλληλόμορφο STR 2  10 επαναλήψεις GATA. Αναμενόμενα πρότυπα ζωνών στο πήκτωμα για τους τρεις πιθανούς γονοτύπους: (6,6)  για τις έξι επαναλήψεις. (10,10)  για τις δέκα επαναλήψεις. (6,10)  ετερόζυγο.

γενετικός χάρτης υψηλής πυκνότητας 5.264 μικροδορυφόροι εντοπίζονται σε 2.335 χρωμοσωμικούς τόπους.

Συμπέρασμα Κατασκευή γενετικών χαρτών Χρησιμοποιούνται δεδομένα ανασυνδυασμού: από γενετικές διασταυρώσεις στην περίπτωση πειραματικών οργανισμών. από γενεαλογική ανάλυση στην περίπτωση του ανθρώπου. Στην ανάλυση της γενετικής χαρτογράφησης χρησιμοποιούνται οι γονιδιακοί δείκτες και οι δείκτες DNA.

Φυσική χαρτογράφηση ενός γονιδιώματος Για οργανισμούς με μικρό γονιδίωμα: Οι γενετικοί χάρτες επιδεικνύουν επαρκή ανάλυση για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας του γονιδιώματος Π.χ.: Πρόγραμμα προσδιορισμού της αλληλουχίας του γονιδιώματος του E.coli: 1.400 γνωστοί γενετικοί δείκτες με μ.ό. 1/3.3 kb. Για οργανισμούς με μεγάλο γονιδίωμα (άνθρωπος): Ανεπαρκής διακριτική ανάλυση του γενετικού χάρτη Αδυναμία προσδιορισμού της αλληλουχίας Ανάγκη για τη δημιουργία ενός λεπτομερούς φυσικού χάρτη, δηλαδή ενός χάρτη γενετικών δεικτών.

Φυσική χαρτογράφηση ενός γονιδιώματος Προκύπτει από την άμεση ανάλυση του DNA του γονιδιώματος Δεν χρησιμοποιούνται: οι γενετικοί ανασυνδυασμοί από γενεαλογική ανάλυση (στους ανθρώπους). οι γενετικές διασταυρώσεις (στα πειραματόζωα) όπως στην περίπτωση των γενετικών χαρτών ως συμπλήρωμα του γενετικού χάρτη. Π.χ.: στον γενετικό χάρτη του ανθρώπινου γονιδιώματος υπάρχουν 24 χάρτες για τον ολοκληρωμένο φυσικό χάρτη, οι οποίο αντιστοιχούν στα 22 αυτοσωμικά χρωμοσώματα, στο Χ και στο Υ.

Φυσική χαρτογράφηση ενός γονιδιώματος Περιγράφονται συνοπτικά μερικοί από τους τύπους φυσικών χαρτών, με σειρά αυξανόμενης ανάλυσης. Παραδείγματα με σειρά αυξανόμενης ανάλυσης: οι κυτταρογενετικοί χάρτες των χρωμοσωμικών ζωνώσεων (βλ. Ενότητα 3.1). οι χάρτες FISH (βλ. Ενότητα 7.3). οι χάρτες περιορισμού. οι χάρτες που βασίζονται σε σωματικά κυτταρικά υβρίδια ακτινοβόλησης (βλ. Ενότητα 7.3). οι χάρτες συναρμολογημάτων κλώνων.

Φυσική χαρτογράφηση ενός γονιδιώματος Χάρτες περιορισμού Χαρτογράφηση με συχνά χρησιμοποιούμενα ένζυμα περιορισμού (π.χ. EcoRI, HindIII, BamHI). Μειονέκτημα: τεράστιος αριθμός θέσεων περιορισμού Άρα: δυσκολία στην ανάλυση των τμημάτων που παράγονται (μετά την ηλεκτροφόρηση στο πήκτωμα αγαρόζης φαίνεται μια συνεχόμενη κηλίδα, αντί για διακριτές ζώνες). Ωστόσο: χρησιμοποίηση ενζύμων περιορισμού με σπάνιες αλληλουχίες αναγνώρισης. Δύο τύποι τέτοιων ενζύμων.

Φυσική χαρτογράφηση ενός γονιδιώματος Χάρτες περιορισμού Πρώτος τύπος ενζύμων: αλληλουχία αναγνώρισης 7- ή 8- bp Παράδειγμα: NotI με αλληλουχία αναγνώρισης: 5΄-GCGGCCGC-3΄ 3΄-CGCCGGCG-5΄ Για γονιδίωμα με 50% GC: 1 θέση αναγνώρισης κάθε 48 = 65.536 bp = 0,065536 Mb (δηλαδή. υπάρχει 1/4 πιθανότητα να υπάρχει μια G στην πρώτη θέση της αλληλουχίας αναγνώρισης, 1/ 4 πιθανότητα να υπάρχει μια C στην δεύτερη θέση, 1/4 πιθανότητα να υπάρχει μια G στην τρίτη θέση κ.ο.κ., και κάθε πιθανότητα πολλαπλασιάζεται για να προκύψει η συνολική πιθανότητα να βρεθεί η δεδομένη αλληλουχία αναγνώρισης).

Φυσική χαρτογράφηση ενός γονιδιώματος Χάρτες περιορισμού Για ένα ένζυμο με αλληλουχία αναγνώρισης 6-bp, όπως η EcoRI, ισχύει μία θέση αναγνώρισης κάθε 46 = 4.096 bp (ενώ με NotI 1 θέση αναγνώρισης κάθε 48 = 65.536 bp) Η NotI κόβει το ανθρώπινο DNA κατά μέσο όρο μια φορά κάθε 10 Mb.

Φυσική χαρτογράφηση ενός γονιδιώματος Χάρτες περιορισμού Δεύτερος τύπος ενζύμων: αλληλουχία αναγνώρισης σπάνια για το DNA που θα χαρτογραφηθεί. Το γονιδίωμα δεν αποτελείται από τυχαία διευθετούμενα ζεύγη βάσεων. Μερικές αλληλουχίες υπάρχουν σε χαμηλή συχνότητα. Παράδειγμα στο ανθρώπινο γονιδίωμα: 5΄-CG-3΄ 3΄-GC-5΄ Για ένζυμα με αυτό το μοτίβο στην αλληλουχία αναγνώρισής τους:  λιγότερες θέσεις αναγνώρισης στο ανθρώπινο DNA σε σχέση με μία μη σπάνια αλληλουχία.

Φυσική χαρτογράφηση ενός γονιδιώματος Χάρτες περιορισμού 1993: ολοκλήρωση του χάρτη περιορισμού βάσει της θέσης περιορισμού NotI του ανθρώπινου χρωμοσώματος 21. Αποτελεί το μοναδικό χάρτη περιορισμού ενός ολόκληρου ανθρώπινου χρωμοσώματος. Ο χάρτης εκτεινόταν σε 37 Mb. Οι θέσεις περιορισμού NotI ήταν χρήσιμοι δείκτες, όταν συναρμολογήθηκε η αλληλουχία του χρωμοσώματος 21 το 2000. Ακόμα και με ένζυμα όπως η NotI, τα οποία «κόβουν» σπάνια το DNA, η κατασκευή ενός χάρτη περιορισμού ολόκληρου του γονιδιώματος είναι πολύ δύσκολη.

Φυσική χαρτογράφηση ενός γονιδιώματος Χάρτες συναρμολογημάτων κλώνων (κλωνοποιημένων γειτονικών τμημάτων) Επιτυγχάνεται υψηλότερη ανάλυση Σειρά διατεταγμένων, μερικώς αλληλοεπικαλυπτόμενων κλώνων οι οποίοι περιέχουν όλο το DNA ενός ολόκληρου χρωμοσώματος ή μέρος του χρωμοσώματος, χωρίς καθόλου κενά. Η λέξη γειτονικό κλωνοποιημένο τμήμα (contig) είναι συντόμευση της λέξης γειτονικός (contiguous). Οι χάρτες των κλωνοποιημένων τμημάτων παρέχουν το πλαίσιο για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας ολόκληρου του γονιδιώματος.

Φυσική χαρτογράφηση ενός γονιδιώματος Χάρτες συναρμολογημάτων κλώνων Ανθρώπινο γονιδίωμα: 24 φυσικοί χάρτες κλωνοποιημένων τμημάτων για κάθε χρωμόσωμα. Μεγάλο μέγεθος του ανθρώπινου γονιδιώματος Οι φορείς που θα χρησιμοποιηθούν πρέπει να έχουν την ικανότητα να δεχθούν μεγάλα κομμάτια ένθετου DNA. Χάρτης πρώτης γενιάς του ανθρώπινου γονιδιώματος: χρησιμοποίηση των φορέων τεχνητών χρωμοσωμάτων ζύμης, YAC (YAC, Yeast Artificial Chromosome) δυνατότητα κλωνοποίησης μερικών εκατοντάδων ζευγών χιλιο(κιλο)βάσεων (kbp) DNA.

Τυπικό τεχνητό χρωμόσωμα ζυμομύκητα (YAC) To YAC περιέχει: ένα τελομερές ζυμομύκητα (TEL) σε κάθε άκρο. ένα κεντρομερές ζυμομύκητα (CEN). ένα δείκτη επιλογής ζυμομύκητα σε κάθε βραχίονα (εδώ TRP1 & URA3). μία αυτόνομα αντιγραφόμενη αλληλουχία (ARS). θέσεις περιορισμού για την κλωνοποίηση του εξωγενούς DNA.

Φυσική χαρτογράφηση ενός γονιδιώματος Χάρτες κλωνοποιημένων γειτονικών τμημάτων Πώς κατασκευάζεται ένας χάρτης με κλωνοποιημένα τμήματα. Δημιουργία μιας βιβλιοθήκης μερικώς επικαλυπτόμενων τμημάτων DNA (όμοια με Ενότητα 16.2). Απομόνωση DNA υψηλού μοριακού βάρους. Μηχανική κατάτμηση (π.χ. πέρασμα από βελόνα σύριγγας). Δημιουργία μιας ολόκληρης συλλογής τυχαίων, μερικώς αλληλοεπικαλυπτόμενων τμημάτων του γονιδιώματος. Τα τμήματα που παράγονται με αυτό τον τρόπο έχουν λεία άκρα.

Φυσική χαρτογράφηση ενός γονιδιώματος Χάρτες κλωνοποιημένων γειτονικών τμημάτων Κλωνοποίηση: Εισαγωγή των τμημάτων του γονιδιωματικού DNA σε έναν φορέα- π.χ. YAC- ο οποίος έχει υποστεί πέψη με ένα ένζυμο περιορισμού όπως το SmaI, το οποίο δημιουργεί λεία άκρα. (Τμήματα DNA με λεία άκρα μπορούν να συνδεθούν μεταξύ τους με αντίδραση η οποία καταλύεται από την DNA λιγάση). Η βιβλιοθήκη των παραχθέντων κλώνων YAC μπορεί να αντιστοιχεί σε ολόκληρο το γονιδίωμα, εάν χρησιμοποιείται το ολικό DNA ως πηγή. σε ένα συγκεκριμένο χρωμόσωμα, εάν τα χρωμοσώματα έχουν διαχωριστεί με κυτταρομετρία ροής, πριν την απομόνωση του DNA.

Φυσική χαρτογράφηση ενός γονιδιώματος Χάρτες συναρμολογημάτων κλώνων Κλωνοποίηση: Εισαγωγή των τμημάτων του γονιδιωματικού DNA σε έναν φορέα- π.χ. YAC- (κόβεται με ένα ένζυμο περιορισμού όπως το SmaI, το οποίο δημιουργεί λεία άκρα). Η βιβλιοθήκη των παραχθέντων κλώνων YAC μπορεί να αντιστοιχεί : σε ολόκληρο το γονιδίωμα, εάν χρησιμοποιείται το ολικό DNA ως πηγή. σε ένα συγκεκριμένο χρωμόσωμα, εάν τα χρωμοσώματα έχουν διαχωριστεί με κυτταρομετρία ροής, πριν την απομόνωση του DNA.

Φυσική χαρτογράφηση ενός γονιδιώματος Χάρτες κλωνοποιημένων γειτονικών τμημάτων Κυτταρομετρία ροής Κύτταρα (ή συστατικά αυτών, όπως π.χ. τα χρωμοσώματα), σημασμένα με φθορισμό διέρχονται από ένα αισθητήριο όργανο μέσω του οποίου κατευθύνεται μια ακτίνα laser. Οι ανιχνευτές μετράνε τον εκπεμπόμενο φθορισμό και τα δεδομένα εισάγονται σε έναν υπολογιστή. Τα όργανα κυτταρομετρίας ροής μπορούν να εκτιμήσουν φυσικά χαρακτηριστικά, όπως π.χ. το μέγεθος και το σχήμα των χρωμοσωμάτων, διευκολύνοντας τον διαχωρισμό αυτών των χαρακτηριστικών, ως διαφορετικά του οργανισμού.

Φυσική χαρτογράφηση ενός γονιδιώματος Χάρτες κλωνοποιημένων γειτονικών τμημάτων Πώς συναρμολογούνται οι κλώνοι; Καταλληλότερος τρόπος: η χρήση τεχνικών αποτύπωσης DNA (DNA fingerprinting) Τυχαία τυποποίηση των κλώνων Συναρμολόγηση αυτών βάσει επικαλύψεων Παραδείγματα αποτύπωσης DNA στην Ενότητα 17.5. Το πιο χρήσιμο πρωτόκολλο σε αυτήν την περίπτωση περιλαμβάνει χαρτογράφηση STS.

Φυσική χαρτογράφηση ενός γονιδιώματος Χάρτες συναρμολογημάτων κλώνων Πώς συναρμολογούνται οι κλώνοι; A B C D C D E F G G H I

Φυσική χαρτογράφηση ενός γονιδιώματος Χάρτες συναρμολογημάτων κλώνων Πώς συναρμολογούνται οι κλώνοι; Εικόνα 18.1: χάρτης κλωνοποιημένων τμημάτων YAC συναρμολογημένων με χαρτογράφηση STS. Χαρτογράφηση των θέσεων των STSs στους κλώνους YAC μέσω ανιχνευτών ενισχυμένων με PCR. Σύγκριση των χαρτών STS σε κάθε κλώνο YAC. Στόχος: εύρεση κλώνων που μοιράζονται μερικά STSs (⇨ μερική επικάλυψη του κλωνοποιημένου DNA).

Αντιπροσωπευτικός χάρτης συναρμολογήματος κλώνων YAC με βάση τη χαρτογράφηση δεικτών STS. iGenetics Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009 52

1992: χάρτες με κλώνους YAC για τα ανθρώπινα χρωμοσώματα 21 και Υ. χάρτης με κλώνους YAC για το 75% του ανθρώπινου γονιδιώματος. Τεχνικά προβλήματα: σε πολλές περιπτώσεις, το κλωνοποιημένο DNA στους φορείς YAC περιείχε DNA από περισσότερες της μίας τοποθεσίες.

Κατασκευή ενός υβριδίου ακτινοβολημένων κυττάρων Ανθρώπινα κύτταρα ακτινοβολούνται με ακτίνες Χ. Τα χρωμοσώματα τεμαχίζονται σε μικρότερα τμήματα. Τα κύτταρα θανατώνονται, αλλά τα χρωμοσωμικά τμήματα «διασώζονται» με σύντηξη των ακτινοβολημένων κυττάρων με κύτταρα τρωκτικών. Τα χρωμοσωμικά τμήματα ενσωματώνονται στα χρωμοσώματα των τρωκτικών.

Δομική γονιδιωματική Δύο γενικές προσεγγίσεις: Χαρτογράφηση Κατασκευή γενετικών και φυσικών χαρτών αυξημένης ανάλυσης σε τμήματα του γονιδιώματος Κατόπιν, προσδιορισμός της αλληλουχίας τους. Τυχαία στόχευση ολόκληρου του γονιδιώματος (WGS, Whole-Genome Shotgun) «Κατακερματισμός» ολόκληρου του γονιδιώματος σε τυχαία, αλληλοεπικαλυπτόμενα τμήματα στα οποία προσδιορίζεται η αλληλουχία. Συναρμολόγηση μέσω υπολογιστή με βάση τις αλληλεπικαλύψεις μεταξύ των τμημάτων. Σε αυτήν την προσέγγιση, δεν είναι γνωστό από πριν πού εντοπίζεται κάθε τμήμα.

Τυχαία στόχευση ολόκληρου του γονιδιώματος (WGS, Whole-Genome Shotgun) Haemophilus influenzae Αργότερα με βελτίωση της τεχνικής: ανθρώπινο γονιδίωμα (Celera Genomics, J.Craig Venter), 2000, επανάληψη 5 φορές. 97 % του γονιδιώματος, πλήρως συγκροτημένο, με εξαίρεση τα κενά που προκύπτουν από το 3 τοις εκατό που υπολείπεται.

νουκλεοτιδικής αλληλουχίας Εύρεση νουκλεοτιδικής αλληλουχίας με τυχαία στόχευση ΕΙΚΟΝΑ 18.2 Η διαδικασία ταυτο- ποίησης της αλλη- λουχίας ενός γονι- διώματος με την προσέγγιση τυφλής στόχευσης.

Βακτηριακά γονιδιώματα Haemophilus influenzae Ο πρώτος κυτταρικός οργανισμός. Μέγεθος γονιδιώματος τυπικό μεταξύ των βακτηρίων. Σύσταση γονιδιώματος σε CG: παρόμοια με του ανθρώπου. Institute for Genomic Research το 1995. Γονιδίωμα μεγέθους 1,83-Μb (1.830.137 bp). Προσέγγιση της τυχαίας στόχευσης, λόγω μη ύπαρξης άλλου είδους χάρτη.

Haemophilus influenzae Αναγνώριση πιθανών γονιδίων: Έλεγχος και στις δύο αλυσίδες για θεωρούμενα γονίδια- ανοικτά πλαίσια ανάγνωσης (ORF, Open Reading Frame). πιθανές περιοχές κωδικοποίησης αμινοξέων. κωδικόνιο έναρξης (AUG  ATG στην αλληλουχία DNA) κωδικόνιο τερματισμού (TAG, TAA, ή TGA στην αλληλουχία DNA) «αυθαίρετα»: ORF >100 κωδικόνια  στατιστικώς πιθανά γονίδια. Τα αναγνωρισμένα ORFs για ολόκληρο το γονιδίωμα αναζητούνται σε νουκλεοτιδικές και αμινοξικές βάσεις δεδομένων, ώστε να αναγνωριστούν ειδικά τα γονίδια. πλήρες μικροβιακό γονιδίωμα: για όλες τις κωδικές περιοχές. για άλλα στοιχεία (επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες, οπερόνια, μεταθετά στοιχεία).

Haemophilus influenzae Προβλέφθηκαν: 1.743 γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες (85 % του γονιδιώματος) Από αυτά: 736 δεν ταιριάζουν σε κάποια πρωτεΐνη των βάσεων δεδομένων ή ταιριάζουν μόνο με πρωτεΐνες που συμβολίζονται υποθετικές Τα υπόλοιπα 1.007 ORF ταιριάζουν σε γονίδια με γνωστή λειτουργία στη βάση δεδομένων. Αυτού του είδους το αποτέλεσμα είναι συνηθισμένο σε μελέτες γονιδιωμάτων. Πολλά γονίδια έχουν γνωστές λειτουργίες, ενώ ένα σημαντικό ποσοστό αυτών έχουν άγνωστη λειτουργία και απαιτείται να γίνουν υποθέσεις που θα επαληθευτούν επιστημονικά, ώστε να προσδιοριστεί η λειτουργία τους.

Το τεκμηριωμένο γονιδίωμα του H. Influenzae. ΕΙΚΟΝΑ 18.3 Το τεκμηριωμένο γονιδίωμα του H. Influenzae. iGenetics Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009 61

Βακτηριακά γονιδιώματα Escherichia coli 1997: Ε.coli K12, Genome Center, Πανεπιστήμιο Wiscosin, Madison Το 6ο γονιδίωμα που προσδιορίστηκε Μέθοδος: τυχαία στόχευση Ε.coli : κατώτερο έντερο ζώων (& ανθρώπου) Στο εργαστήριο: οργανισμός – μοντέλο για τη μοριακή βιολογία, τη γενετική και τη βιοτεχνολογία. Μέγεθος: 4,64Mb (4.639.221bp) 4.288 ORF : 87.8 % του γονιδιώματος 38% από αυτά: άγνωστη λειτουργία.

Γενετικός χάρτης του χρωμοσώματος του E.coli ΕΙΚΟΝΑ 18.9 Κατανομή των πιθανών ORF στο γονιδίωμα του ζυμομύκητα. (Από B. Dujon. 1996. Trends Genet 12: 263-270.) Γενετικός χάρτης του χρωμοσώματος του E.coli Οι αποστάσεις μεταξύ των γονιδίων εκφράζονται σε λεπτά. iGenetics Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009 63

Γονιδιώματα Αρχαίων Methanococcus jannaschii Το πρώτο γονιδίωμα αρχαίου που προσδιορίστηκε πλήρως Υπερθερμόφιλο μεθανογόνο Ανάπτυξη σε 85 C, P έως 200 atm, αυστηρά αναερόβιο Παραγωγή ενέργειας: αναγωγή διοξειδίου του άνθρακα σε μεθάνιο. Τυχαία στόχευση (1996) Πλήρες γονιδίωμα: ένα κύριο κυκλικό χρωμόσωμα 1.664.976 bp (1.682 ORF) δύο κυκλικά πλασμίδια των 58.407bp (44 ORF) και 16.550 bp (12 ORF). Πλειοψηφία γονιδίων παραγωγής ενέργειας, κυτταρικής διαίρεσης και μεταβολισμού: όμοια με τα αντίστοιχα στα βακτήρια Πλειοψηφία γονιδίων αντιγραφής DNA, μεταγραφής και μετάφρασης: όμοια με τα αντίστοιχα στα Ευκάρυα. Επιβεβαίωση των αρχαίων ως ενός από τους κύριους κλάδους.

Ευκαρυωτικά γονιδιώματα Ζύμη (Saccharomyces cerevisae ) Ευκαρυωτικό μοντέλο για πολλά είδη μελετών Πολλά πλεονεκτήματα Κυριότερο: μεγάλη λειτουργική ομοιότητα με τα θηλαστικά Γονιδίωμα 16 χρωμοσωμάτων (1996) Μέγεθος: 12.067.280 bp Περίπου 969.000 bp επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών υπολογίστηκε πως δεν συμπεριλαμβανόταν στην δημοσιευμένη αλληλουχία 6.183 ORF, μόνο 233 με ιντρόνια 1000 γονίδια είχαν προσδιοριστεί με γενετική ανάλυση Άγνωστη η λειτουργία περίπου του ενός τρίτου των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες.

Γονοτυπικός προσδιορισμός φύλου στον Caenorhabditis elegans Νηματώδης σκώληκας Πολύ καλό βιολογικό υλικό το ώριμο άτομο διαθέτει μόνο 959 κύτταρα που έχουν μελετηθεί σε όλα τα στάδια της ανάπτυξης Δύο φύλα: ΧΧ (Χ:Α = 1) ερμαφρόδιτο ΧΟ (Χ:Α = 0,5) αρσενικό.

C. elegans [XX] [XO] [XX] [XO] [XX]

Caenorhabtitis elegans Νηματώδης σκώληκας Caenorhabtitis elegans (ονομάζεται και «σκουλήκι») Tο πρώτο γονιδίωμα πολυκύτταρου ευκαρυωτικού οργανισμού που προσδιορίστηκε Μακρύ κυλινδρικό σώμα μήκους 1mm, λεία επιφάνεια Ζει στο χώμα - τρέφεται με μικρόβια Απλό νευρικό σύστημα Εκδήλωση σειράς συμπεριφορών Μάθηση & εκτέλεση απλών καθηκόντων Σημαντικός οργανισμός-μοντέλο για τη μελέτη των μοριακών και γενετικών μηχανισμών: της εμβρυογένεσης. της μορφογένεσης. της ανάπτυξης & και λειτουργίας του νευρικού συστήματος. της γήρανσης. της συμπεριφοράς.

Caenorhabtitis elegans Νηματώδης σκώληκας Caenorhabtitis elegans Σχεδόν πλήρης φυσικός χάρτης τη δεκαετία του 1980 Αλληλουχία του γονιδιώματος: Sydney Brenner (1990) Ανακοίνωση προσχέδιου: 1998 Γονιδίωμα: 100,3 Mb 20.443 γονίδια, 1.270 εκ των οποίων δεν κωδικοποιούν πρωτεΐνες.

ΕΙΚΟΝΑ 18.7 Χρωμοσωμικές περιοχές της E. coli, του ζυμομύκητα, της φρουτόμυγας και του ανθρώπου, από τη σύγκριση των οποίων φαίνεται η διακύμανση της γονιδιακής πυκνότητας στα διάφορα γονιδιώματα. iGenetics Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009 70

Τέλος Ενότητας

Χρηματοδότηση Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό έχει αναπτυχθεί στα πλαίσια του εκπαιδευτικού έργου του διδάσκοντα. Το έργο «Ανοικτά Ακαδημαϊκά Μαθήματα στο Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων» έχει χρηματοδοτήσει μόνο τη αναδιαμόρφωση του εκπαιδευτικού υλικού. Το έργο υλοποιείται στο πλαίσιο του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» και συγχρηματοδοτείται από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο) και από εθνικούς πόρους.

Σημειώματα

Σημείωμα Ιστορικού Εκδόσεων Έργου Το παρόν έργο αποτελεί την έκδοση 1.0. Έχουν προηγηθεί οι κάτωθι εκδόσεις: Έκδοση 1.0 διαθέσιμη εδώ. http://ecourse.uoi.gr/course/view.php?id=1303.

Σημείωμα Αναφοράς Copyright Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων, Διδάσκουσα: Επίκουρη Καθηγήτρια Αμαλία-Σοφία Αφένδρα. «Εφαρμοσμένη Γενετική. Γονιδιωματική». Έκδοση: 1.0. Ιωάννινα 2014. Διαθέσιμο από τη δικτυακή διεύθυνση: http://ecourse.uoi.gr/course/view.php?id=1303.

Σημείωμα Αδειοδότησης Το παρόν υλικό διατίθεται με τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Αναφορά Δημιουργού - Παρόμοια Διανομή, Διεθνής Έκδοση 4.0 [1] ή μεταγενέστερη. [1] https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/.