I GRAĐENJE PEPTIDNE VEZE MAČVANSKA SREDNJA ŠKOLA AMINOKISELINE I GRAĐENJE PEPTIDNE VEZE KLARA KAKUČKA, prof. hemije

Aminokiseline Aminokiseline su organska jedinjenja sa dve funkcionalne grupe : amino NH2 i karboksilnom COOH Najvažnije su α- aminokiseline kod kojih su obe grupe na istom C-atomu OPŠTA FORMULA

Aminokiseline Ulaze u sastav protena Hidrolizom proteina dobija se svega 20 α-aminokiselina Klasifikacija aminokiselina prema: Polarnosti Funkcionalnim grupama u bočnom nizu Biosintezi ( esencijalne i neesencijalne)

Nepolarne alifatične AK

Polarne nenaelektrisane AK, sadrže OH grupu

Aminokiseline sa sumporom

Kisele AK- monoaminodikarboksilne

Bazne AK - diaminomonokarboksilne

Aromatične AK

Imino AK

Aminokiseline Bazna svojstva amino (NH2) grupe Kisela svojstva karboksilne (COOH) grupe Amfoterna jedinjenja (i kisela i bazna) Zato se u vodenim rastvorima nalaze u obliku bipolarnog jona (“cviter” jona)

Aminokiseline Zavisnost oblika od kiselosti sredine Izolektrična tačka je pH-vrednost na kojoj je aminokiselina neutralna tj. naelektisanja su izjednačena. Na toj IT aminokiseline su najmanje rastvorljive i talože se. Ne kreću se u električnom polju (elektroforeza- razdvajanje AK pri različitim pH).

Oblik jona u zavisnosti od pH

Aminokiseline

Aminokiseline-Podela prema biosintezi: Neesencijalne – mogućnost biosinteze Alanin Cistein Asparaginska kiselina Glutaminska kiselina Glicin Norleucin Serin Tirozin Esencijalne – nemogućnost biosinteze Arginin Histidin Izoleucin Leucin Lizin Metioni Fenilalanin Treonin Triptofan Valin

Optička aktivnost Važno za strukturu proteina Sve aminokiseline osim glicina su optički aktivne L- konfiguracije Važno za strukturu proteina

Hemijske osobine AK Imaju svojstva i kiselina i baza ali i karakteristična samo za AK Dokazna reakcija sa ninhidrinom- plavo obojenje Građenje dipeptida i polipeptida

Peptidna veza Reakcijom amino grupe jedne AK i karboksilne grupe druge AK uz izdvajanje vode nastaje peptidna veza i dipeptid

Peptidna veza Na svakom molekulu ostaje po jedna slobodna amino grupa na N-kraju i karboksilna na drugom C- kraju koji mogu da reaguju sa novom AK, i grade polipeptide (do 100 AK) i proteine (preko 100 AK)

Struktura peptidne veze NH i C=O grupe se nalaze u jednoj ravni Okretanje molekula može samo oko C-R veze.

Taložne reakcije proteina Biuretska reakcija Ninhidrinska reakcija Ksantoproteinska reakcija

Biuretska reakcija

Ksantoproteinska reakcija Za aromatične AK

Ninhidrinska reakcija

Izdvajanje i prečišćavanje proteina Cilj ovih metoda je izdvojiti protein od ostalih u smesi ili tkivu. Postupak je težak jer su proteini osjetljivi i lako se denaturišu. Postupci se temelje na tri fizičko-hemijska svojstva, te su i metode razvijene prema tim parametrima: razdvajanje prema veličini molekula razdvajanje prema naelektrisanju molekula razdvajanje prema specifičnim vezama ( afinitetna hromatografija) Razdvajanje proteina prema njihovoj izoelektričnoj tački. Pomoću amfolita stvori se pH-gradijent, pa se aminokiselina zaustavljaju na područjima njihove izoelektrične tačke, i od toga mesta se više pomeraju jer električno polje ne djeluje na njih jer postanu neutralne.

Razdvajanje RAZDVAJANJE PREMA RASTVORLJIVOSTI Proteini se talože neutralnim solima. Primer je aluminij sulfat. Rastvorljivost je najmanja pri izoelektričnoj tački. RAZDVAJANJE ADSORPCIJOM Neki nerastvorni neorganska ili organska jedinjenja mogu adsorbovati proteine kao npr. hidroksilapatit, koji se koristi i u hromatografij. RAZDVAJANJE PREMA NAELEKTRISANJU Aminokiseline u vodenom rastvoru su polivalentne. Negativno naelektrisanje daju karboksilne grupe bočnih lanaca glutaminske i asparaginske kiseline i terminalna –COOH grupa, Pozitivno naelektrisanje daje –NH2 grupa bočnih lanaca asp, liz i his i teminalna –NH2 grupa. Niski pH sprečava disocijaciju –COOH, a kod visokog pH aminogrupa je neutralna.

ELEKTROFOKUSIRANJE Pri određenom pH aminokiseline imaju i različito naelektrisanje. U električnom polju one putuju različitom brzinom. Molekuli sa više negativnih naelektrisanja putuju prema anodi. Elektroforeza se vrši na nosačima, koji osim celuloznog acetata, mogu biti poliakriamidni gelovi. Njihovom različitom polimerizacijom se postiže i različita veličina pora, pa se prema tome mogu stvoriti i molekulska sita, koja razdvajaju proteine prema njihovoj veličini molekula. U medicini se analizira serum elektroforezom na nosaču koji može biti papir, celulozni acetat, skrobni ili poliakrilamidni gel. Iz dobivenog elektrograma se iščitaju udeo pojedinih vrsta proteina seruma.

HROMATOGRAFIJA NA JONSKIM IZMENJIVAČIMA Kao izmjenjivač se ne koriste sintetske smole jer mogu denaturisati protein. Kao adsorbens se koriste preparati celuloze u koje se mogu umetnuti naelektrisani elementi. Hromatografija se provodi na koloni, a u eluentu se UV-adsorpcijom dokazuju sastavnice. ODVAJANJE PREMA VELIČINI MOLEKULA Proteini su često različitih veličina. Za njihovo razdvajanje koristi se ultracentifuga, SDS-elektroforeza i hromatografija ekskluzijom. Preparativno odvajanje se vrši u gradijentu gustine centrifugiranjem. Rrastvor cesijum-hlorida ima različitu gustinu, pa proteini putuju do onoga mesta u kojem lebde tj. do mesta gdje je gustina ekvivalentna njihovoj. SDS-ELEKTROFOREZA Pomoću natrij-dodecilsulfata ( SDS ) proteini se denaturišu, Dodecilsulfat se veže na njih i oni poprimaju negativno naelektrisanje proporcionalno njihovoj dužini.

GEL FILTRACIJA Stacionarna faza je polisaharidni gel koji deluje kao molekulsko sito. Sadrži malene šupljine u koje mogu ući molekuli. Molekulska Petera proteina se može odrediti centrifugom. Proteini čija je gustina veća od gustine rastvora mogu se taložiti. Zemljina sila teže nije dovoljna, nego je potrebno stvoriti centripetalnu silu. Sedimentacija proteina se može meriti optičkim metodama. Tako se odredi konstanta sedimentacije u meri svedberg ( 1S = 〖10〗^(-13)s ). Relativna molekulska Petera se može izračunati iz konstante sedimentacije ako se zna konstanta difuzije i gustina proteina. Jednostavnija metoda određivanja molekulske Petere je hromatografija na molekulskim sitima.

AFINITETNA HROMATOGRAFIJA Zasniva se na principu da se proteini vežu na određene manje molekule i razdvajanje se vrši na temelju njihove povezanosti ( afinitetu ) s manjim molekulima. Na slici se vidi kako se određeni protein veže za molekulu ˝bait˝, dok drugi ne i na temelju toga će se razdvojiti u hromatografiji.