Tehnike u čijoj je osnovi interakcija antigen-antitelo

Testovi zasnovani na Ag/At reakciji Antigen-antitelo (Ag-At) reakcije čine osnovu mnogih in vitro metoda koje se obavljaju u laboratorijskim uslovima u dijagnostičke ili istraživačke svrhe. Ispituje se prisustvo antigena ili antitela u odgovarajućem uzorku (serumu, likvoru, ćelijskoj kulturi...). - infektivni agens ili njegov deo (npr. HbsAg, p24 HIV...) - drugi molekuli (npr. citokini, hormoni, komponente komplementa, tumor markeri, proteini akutne faze , Ig...) - ukupni Ig (pojedine klase) ili specifična At za određeni Ag Tradicionalno se zovu i serološke reakcije 2

Testovi zasnovani na Ag/At reakciji Mogi biti kvalitativni i kvanititativni 1. Kvalitativni rezultat može biti pozitivan ili negativan 2. Kvanititativni za određivanje, Ag, ukupnih ili specifičnih At - negativna Kontrole bez validnih kontrola ovi testovi nemaju značaj - pozitivna

Tip reakcije antigena i antitela zavisi od prirode antigena Solubilni antigen – imunoprecipitacija Partikularni antigen – imunoaglutinacija 1 2 3 1 2 3 Ag-At KOMPLEKSI: AGLUTINACIJA: REZULTAT: MALI NE POSTOJI NEPOUZDAN (LAŽNO NEGATIVAN) FENOMEN PROZONE VELIKI POSTOJI POUZDAN (POZITIVAN) MALI NE POSTOJI NEPOUZDAN (LAŽNO NEGATIVAN)

Imunoaglutinacija 1. Direktna (aktivna) 2. Indirektna (pasivna) 3. Antiimunoglobulinski test (Coombsov test) 4. Inhibicija hemaglutinacije

1. Direktna aglutinacija Aktivna aglutinacija Testovi za dokazivanje bakterija Salmonella, vibrio... Y + 

Test za dokazivanje krvnih grupa Princip testa: utvrđivanje nepoznatih Ag na Er ispitanika korišćenjem poznatih At Materijal: ispitivana krv, test reagensi, pločice

Titar antitela Titar antitela je laboratorisjki test za određivanje prisustva i količine antitela u serumu predstavlja recipročnu vrednost najvećeg razblaženja seruma koje daje jasno vidljivu aglutinaciju.

2. Indirektna aglutinacija Pasivna (indirektna) aglutinacija Antigen ili antitela su vezana za neke čestice kao što su lateks ili karbonske čestice Y + 

Za određivanje prisustva anti-IgG antitela Rose Waalerov test Za određivanje prisustva anti-IgG antitela Stari test- Kada se ovčiji eritrociti pomešaju sa određenom koncentracijom antiseruma specifičnog za ovčije eritrocite, a kada se doda serum pacijenata sa reumatoidnim artritisom dolazi do aglutinacije Test lateks aglutinacije

3. Antiimunoglobulinski test (Coombsov test) Koriste se anti-imunoglobulinska antitela da bi se detektovala antitela koja dovode do hemolitičke bolesti novorođenčeta (lat. Erythroblastosis fetalis). Hemolitička bolest novorođenčeta -majka produkuje IgG antitela specifična za Rh antigen Anti-Rh IgG antitela oblažu fetalne eritrocite, koji bivaju uništeni od strane fagocita u jetri što prouzrokuje hemolitičku anemiju fetusa i smrt novorođenčeta Detekcija anti-Rh antitela je bila teška dok nisu otkrivena anti-humana imunoglobulinska antitela

4. Inhibicija hemaglutinacije

Imunoprecipitacija I Tečni medijum Interfacijalni test prstena Klasična kvantitativna imunoprecipitacija Nefelometrija II Polučvrsti medijum Dvostruka imunodifuzija Jednostruka radijalna imunodifuzija - RID

I 1. Interfacijalni test prstena Kvalitativna metoda za detekciju Bacillus anthracus (Ascolij-eva reakcija)

I 2. Nefelometrija Brza i jednostavna metoda za kvantifikaciju mnogih antigena u različitim biološkim tečnostima (serum, plazma, likvor, sinovijalna tečnost, itd) Mešanje konstantne količine visoko purifikovanog monospecifičnog antitela i rastvora različitih koncentracija antigena Mikroprecipitati lebde - zamućenje rastvora Stepen zamućenja se određuje na osnovu rasipanja upadnog zraka svetlosti (nefelometrija) i proporcionalan je koncentraciji antigena

II 1. Dvostruka imunodifuzija Ag At 1 2 3 Kroz polučvrst medijum difunduju i antigen i antitelo i na mestu optimalnog odnosa obrazuje se precipitinska linija Udaljenosti precipitinske linije od mesta nanošenja antigena i antitela zavisi od koeficijenta difuzije antigena i antitela, i njihove koncentracije Broj precipitinskih linija zavisi od broja prisutnih antigen-antitelo sistema Mogućnost detekcije broja antigena odnosno antitela, identifikaciju antigena ili antitela, i određivanje srodnosti raznih antigena.

Imunoprecipitacija Brz i senzitivan test za detekciju proteina/Ag posebno onih koji su prisutni u maloj koncentraciji

Imunotestovi sa obeleženim antigenom ili antitelom Radioimunotestovi (RIA) Enzimimunotestovi (ELISA) Imunohistohemijske tehnike formiranje velikih nesolubilnih imunskih kompleksa nije neophodno

(engl. Radioimmunoassay – RIA) 1. Radioimunotestovi (engl. Radioimmunoassay – RIA) Prvi razvijeni test sa obeleživačima Velika osetljivost Upotreba: detekcija nivoa hormona, lekova i proteina koji su prisutni u veoma niskoj conc. PRAKTIČNI NEDOSTACI: Skupa oprema Kratko vreme poluraspada radioizotopa Potencijalna štetnost za zdravlje izvođača Skladištenje otpada

(engl. Radioimmunoassay – RIA) 1. Radioimunotestovi (engl. Radioimmunoassay – RIA) RIA sa obeleženim Ag RIA sa obeleženim At RIA u tečnom medijumu RIA u čvrstom medijumu

Klasična, kompetitivna RIA RIA sa obeleženim Ag Klasična, kompetitivna RIA Obeleživači: I125, I131, H3, C14 Princip testa: kompetitivno vezivanje radiobeleženog Ag i neobeleženog Ag iz uzorka za specifično At u rastvoru Primena: detekcija izuzetno malih conc. Ag (10-12 g/mol) npr. hormona (HCG; FSH), HBAg, steroida, PG, citokina...

Klasična, kompetitivna RIA RIA sa obeleženim Ag Klasična, kompetitivna RIA Količina Ag prisutna u uzorku obrnutno proporcionalna detektovanom nivou radioaktivteta

Klasična, kompetitivna RIA RIA sa obeleženim Ag Klasična, kompetitivna RIA Standardna kriva se dobija dodavanjem rastućih koncentracija neobeleženog Ag konstatnim količinama obeleženog Ag i specifičnog At

Nekompetitivna, “sandwich” RIA RIA sa obeleženim At Nekompetitivna, “sandwich” RIA Povećana osetljivost i preciznost

RIA sa obeleženim At Nekompetitivna, “sandwich” RIA RAST test- Radioallerosorbent test - Određivanje koncentracije alergen specifičnih IgE antitela

RIA sa obeleženim At Nekompetitivna, “sandwich” RIA RIST test- Radioimmunosorbent test - Određivanje koncentracije ukupnih IgE antitela (detekcija 10-9 g/ml)

Enzimski imunotestovi Fluorescentni imunotestovi Radioimunotestovi Enzimski imunotestovi Fluorescentni imunotestovi Imunohistohemijske metode Za vizuelizaciju nije neophodno dobijanje velikih nesolubilnih kompleksa

2. Enzimski imunotestovi (engl. Enzyme immunoassay – EIA; Enzyme-linked immunosorbent assay- ELISA) Detekcija Ag ili At u tečnim uzorcima (najčešće u serumu ili supernatantima) Obeleživač je enzim, a obeleženo je primarno At (specifično za Ag) ili sekundarno (anti-Ig At). Princip vizuelizacije: promena boje supstrata pod dejstvom enzima Detekcija: ELISA čitač Enzim Supstrat peroksidaza H2O2 + ortofenil diamin (OPD) ili tetrametilbenzidin (TMB) Alkalna fostataza P-nitro-fenil-fosfat

ELISA Danas najčešće u upotrebi dva vida nekompetetivne ELISA: Indirektna ELISA (detekcija At) Sandwich ELISA (detekcija Ag) Indirektna ELISA Sandwich ELISA

Metode bazirane na komplementu formiranje velikih nesolubilnih imunskih kompleksa nije neophodno

Test fiksacije komplementa Koriste se eritrociti ovce, anti-eritrocitna At i komplement, plus specifičan antigen (ukoliko se ispituje At u serumu) ili specifično At (ukoliko se ispituje Ag u serumu).

Test fiksacije komplementa 1. ako je At ili Ag prisutan u serumu pacijenta, onda je komplement potpuno iskorišćen tako da eritorciti nisu lizirani. 2. ako At ili Ag nisu prisutni onda komplement nije iskorišćen tako da se vezuje za anti-eritrocitna At i dovodi do lize eritrocita. Koristi se za dokazivanje infekcije Treponema pallidum Wassermann-ov test je jedna forma testa fiksacije komplementa. Ag(kardiolipin) nema Ag Ag Y serum pacijenta sa inaktivisanim komplementom Ag Y

Primena testova zasnovanih na reakciji antigena i antitela

(engl. Radioimmunoassay – RIA) 1. Radioimunotestovi (engl. Radioimmunoassay – RIA) Prvi razvijeni test sa obeleživačima Velika osetljivost Upotreba: detekcija nivoa hormona, lekova i proteina koji su prisutni u veoma niskoj conc. PRAKTIČNI NEDOSTACI: Skupa oprema Kratko vreme poluraspada radioizotopa Potencijalna štetnost za zdravlje izvođača Skladištenje otpada

(engl. Radioimmunoassay – RIA) 1. Radioimunotestovi (engl. Radioimmunoassay – RIA) RIA sa obeleženim Ag RIA sa obeleženim At RIA u tečnom medijumu RIA u čvrstom medijumu

Klasična, kompetitivna RIA RIA sa obeleženim Ag Klasična, kompetitivna RIA Obeleživači: I125, I131, H3, C14 Princip testa: kompetitivno vezivanje radiobeleženog Ag i neobeleženog Ag iz uzorka za specifično At u rastvoru Primena: detekcija izuzetno malih conc. Ag (10-12 g/mol) npr. hormona (HCG; FSH), HBAg, steroida, PG, citokina...

Klasična, kompetitivna RIA RIA sa obeleženim Ag Klasična, kompetitivna RIA Količina Ag prisutna u uzorku obrnutno proporcionalna detektovanom nivou radioaktivteta

Klasična, kompetitivna RIA RIA sa obeleženim Ag Klasična, kompetitivna RIA Standardna kriva se dobija dodavanjem rastućih koncentracija neobeleženog Ag konstatnim količinama obeleženog Ag i specifičnog At

Nekompetitivna, “sandwich” RIA RIA sa obeleženim At Nekompetitivna, “sandwich” RIA Povećana osetljivost i preciznost

RIA sa obeleženim At Nekompetitivna, “sandwich” RIA RAST test- Radioallerosorbent test - Određivanje koncentracije alergen specifičnih IgE antitela

RIA sa obeleženim At Nekompetitivna, “sandwich” RIA RIST test- Radioimmunosorbent test - Određivanje koncentracije ukupnih IgE antitela (detekcija 10-9 g/ml)

Enzimski imunotestovi Fluorescentni imunotestovi Radioimunotestovi Enzimski imunotestovi Fluorescentni imunotestovi Imunohistohemijske metode Za vizuelizaciju nije neophodno dobijanje velikih nesolubilnih kompleksa

2. Enzimski imunotestovi (engl. Enzyme immunoassay – EIA; Enzyme-linked immunosorbent assay- ELISA) Detekcija Ag ili At u tečnim uzorcima (najčešće u serumu ili supernatantima) Obeleživač je enzim, a obeleženo je primarno At (specifično za Ag) ili sekundarno (anti-Ig At). Princip vizuelizacije: promena boje supstrata pod dejstvom enzima Detekcija: ELISA čitač Enzim Supstrat peroksidaza H2O2 + ortofenil diamin (OPD) ili tetrametilbenzidin (TMB) Alkalna fostataza P-nitro-fenil-fosfat

ELISA Danas najčešće u upotrebi dva vida nekompetetivne ELISA: Indirektna ELISA (detekcija At) Sandwich ELISA (detekcija Ag) Indirektna ELISA Sandwich ELISA

I) Imunoglobulini i drugi serumski proteini Abnormalnosti serumskih imunoglobulina pojavljuju se u autoimunskim infektivnim imunodeficijentnim i limfoproliferativnim poremećajima Kvalitativne, kvantitativne i funkcionalne procene serumskih imunoglobulina

Testovi za procenu humoralnog imuniteta u kliničkoj praksi Mehanizmi molekulskih interakcija značajne za ostvarivanje funkcija humoralnog imunskog odgovora: kvantitativno određivanje koncentracija imunološka identifikacija karakterizacija Određivanje ukupnih proteina Biuretska, tanin turbidimetrijska, metoda taloženja trihlorsirćetnom kiselinom i dr Elektroforetske tehnike Metoda po Grabar-Williams-u ili mikrozonska elektroforeza po Shidigger-u, na acetatnoj celulozi ili agaroznom gelu

Serumske elektorforeze (jednostavna, jeftina, brza tehnika) obezbeđuje informacije o povećanju i smanjenju ukupnih serumskih imunoglobulina i prisustvu monoklonskih traka

Karakterizacija – imunofiksacija Kvantifikacija klasa imunoglobulina – nefelometrija Funkcionalna aktivnost – merenje izoaglutinina (IgM)

Zonska elektroforeza (semikvantitativna)

Karakterizacija paraproteina (patološki proteini) – imunoelektroforeza i imunofiksacija Kvantifikacija paraproteina – kvantifikacijom imunoglobulina, denzitometrijom (Bence-Jones proteini)

Kvantifikacija imunoglobulina i drugih proteina Radijalna imunodifuzija (RID) Nefelometrija Kvantifikacija IgG klasa RID, ELISA, nefelometrija

II) Komplement i imunski kompleksi Rekurentne bakterijske infekcije Autoimunske bolesti sa prominentnim imunski kompleks interakcijama Test titracije komplementa (hemolitički test-CH50/100) C3, C4 i properdin kvantifikacija C3 nefrotski faktor C1 esteraze inhibitor C1q vezujući metod za imunske komplekse cirkulišući imunski kompleksi

III) Autoimunska serologija Autoantitela u tkivima ili serumu

AUTOANTITELA * prisustvo autoantitela je uobičajeno povazano sa imunopotologijom * intezitet oštećenja je povezana sa količinom autoantitela * autoantitela su najčešće specifična za imunodominantne epitope

Indirektna imunofluorescenca (ANA, tkivna autoantitela i anti-neutrofilna citoplazmatska antitetla-ANCA) Aglutinacija (tiroidna antitela, RF) Imunoprecipitacija (ENA-antitela specifična za ekstraktabilni nuklearni antigen, antitela specifična za ds DNK i nuklearne antigene) RIA (anti-ds DNK antitela) i ELISA

FLUOROHROM - KONJUGOVAN DETEKCIJA AUTOANTITELA INDIREKTNOM IMUNOFLUORESCENCOM POZITIVAN REZULTAT (AUTO At+) NEGATIVAN REZULTAT (AUTO At-) EMISIJA SVETLOSTI (FITC  ZELENA) UV ZRACI UV ZRACI NEMA EMISIJE FLUOROHROM - KONJUGOVAN ANTISERUM ZA HUMANI Ig ISPIRANJE ISPIRANJE Y nema SERUM (AUTO At) ISPIRANJE Y AUTO Ag nema ISPIRANJE ĆELIJE STAKLO

Indirektna imunofluorescenca ANCA-Wegener-ova granulamatoza Antitela specifična za ACH receptor (Miastenija gravis) ANA – sistemske reumatske bolesti (SLE, polimozitis, skleroderma, Sjogren-ov sindrom), reakcije na lekove, hronične infekcije, RA i druge autoimunske bolesti Anti-fosfolipidna antitela – anti-fosfolipidni sindrom RF (IgM, IgA ili IgG)

Problemi: * zdrave osobe sa prisutnim autoantitelima * Osobe sa manifestacijama imunopatoloških bolesti, kod kojih očekivana autoantitela nisu detektabilna * nizak nivo autoantitela (IgM) može da bude u vezi sa infekcijom * krosreaktivnost

IV) Fenotipizacija ćelija i funkcionalni testovi Imunski sistem je kontrolisan velikim brojem ćelija i u dobro balansiranom imunskom sistemu ove ćelije međusobno efikasno interaguju U imunskim bolestima taj odnos je poremećen Identifikacija ćelija – fenotipska analiza Određivanje njihove funkcije ili funkcionalnog potencijala – in vitro funkcionalni testovi

V) Citokini, inflamatorni pokazatelji i tumorski markeri Citokini i solubilni citokinski receptori ELISA ELISA spot Merenje mRNK Inflamatorni pokazatelji Serumska elektroforeza CRP - nefelometrija SE Kvantifikacija serumskog β2-mikroglobulina (RID, ELISA) Tumorski markeri RIA, ELISA, imunofluorescenca (tkiva)

VI) Imunohistologija Za identifikaciju ćelijskih antigena i produkata na presecima tkiva Svetlosni, elektronski ili florescentni mikroskop Direktna Indirektna Pozitivne i negativne kontrole

VII) Alergije i hipersenzitivnost Reakcije preosetljivosti Tip I ukupni IgE (RIST) alergen specifični IgE (RAST) in vivo intradermalni test Reakcije preosetljivosti Tip II Coombs-ov test Reakcije preosetljivosti Tip III Autoantitela Reakcije preosetljivosti Tip IV Mantoux kožni test Funkcije T ćelija – proliferacija i produkcija citokina