RNA: Μεταγραφή και επεξεργασία του RNA Μιχάλης Β. Καραμούζης MD, PhD Παθολόγος Ογκολόγος Αναπληρωτής Καθηγητής Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Αθηνών Devlin – Κεφάλαιο 5 Lehninger – Κεφάλαιο 26 Παραδόσεις Αμφιθεάτρου Μάρτιος 2018

Μεταγραφή

Μεταγραφή στους προκαρυώτες Σχετικά απλή….

Ευκαρυώτες - Όχι και τόσο απλή…

Προκαρυωτικά vs Ευκαρυωτικά κύτταρα

Η μεταγραφή στα προκαρυωτικά κύτταρα

RNA πολυμεράση vs DNA πολυμεράση Δεν απαιτεί παρουσία εκκινητή Η ενέργεια που χρειάζεται είναι διπλάσια Συνθέτει RNA με προσανατολισμό 5’ – 3’

RNA πολυμεράση H RNA πολυμεράση του E. coli αποτελείται από: 4 υπομονάδες που σχηματίζουν το ένζυμο-πυρήνα και τον παράγοντα (σ), που συμμετέχει στην αναγνώριση των υποκινητών στο DNA. πυρήνας + σ = ολοένζυμο Το ολοένζυμο συνδέεται με την αλληλουχία του υποκινητή και καταλύει τη δημιουργία «ανοιχτού συμπλόκου» και την έναρξη της μεταγραφής του DNA σε RNA. Κατεύθυνση μεταγραφής

Προκαρυωτικοί υποκινητές Υποκινητής (promoter): αλληλουχία στο DNA υπεύθυνη για έναρξη μεταγραφής Ενισχυτής (enhancer): αλληλουχίες DNA που επάγουν την έναρξη της μεταγραφής μέσο των «ενεργοποιητών»

Προκαρυωτικοί υποκινητές Διαφορετικοί υποκινητές περιέχουν παρόμοιες αλληλουχίες, επιτρέποντας την αναγνώριση μιας συναινετικής αλληλουχίας του υποκινητή Συντηρημένες αλληλουχίες υποκινητών εντοπίζονται μεταξύ των προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών οργανισμών Η επαγωγή της μεταγραφής ρυθμίζεται και από DNA αλληλουχίες που εδράζονται μακριά από τη θέση έναρξης. Οι αλληλουχίες αυτές ονομάζονται ενισχυτές και συναντώνται κυρίως στη σύνθεση των ευκαρυωτικών mRNAs Oι ενισχυτές δρουν μέσω της δέσμευσης ειδικών παραγόντων, που ονομάζονται ενεργοποιητές

Προκαρυωτικοί υποκινητές

Ολοένζυμο της E. coli RNA πολυμεράσης προσδεδεμένο στο DNA  Υπομονάδα Στοιχειομετρία Ρόλος στο ολοένζυμο a 2 Σύνδεση με ρυθμιστικές αλληλουχίες   Σχηματισμός φωσφοδιεστερικών δεσμών ’    Αναγνώριση υποκινητή   Διευκόλυνση στερεοδιάταξης ενζύμου

Ένα προκαρυωτικό γονίδιο μπορεί να διαιρεθεί σε 3 αλληλουχίες με βάση την πορεία της μεταγραφής Αλληλουχία του υποκινητή, «ανωφερικά» του σημείου έναρξης RNΑ-κωδική αλληλουχία Αλληλουχία λήξης

Ολοένζυμο της E. coli RNA πολυμεράσης -35 περιοχή (5’ TTGACA 3 ’) και στην -10 περιοχή (Pribnow box 5’ TATAAT 3’)

Προκαρυωτική Μεταγραφή ΕΝΑΡΞΗ ΕΠΙΜΗΚΥΝΣΗ ΤΕΡΜΑΤΙΣΜΟΣ

Έναρξη της Μεταγραφής σ Ο παράγοντας σ προσδένεται στον υποκινητή Υποκινητής (στη μη κωδική αλυσίδα) 35 περιοχή 10 περιοχή Upstream (ανωφερικό) DNA +1 site σ Ενεργή περιοχή Downstream DNA RNA πολυμεράση Ο παράγοντας σ προσδένεται στον υποκινητή

Έναρξη της Μεταγραφής Ο παράγοντας σ ανοίγει τη διπλή έλικα Template strand Non-template strand +1 site RNA NTPs Ο παράγοντας σ ανοίγει τη διπλή έλικα

Επιμήκυνση Ο υποκινητής πρoσαvατoλίζει τo έvζυμo και επειδή αυτό βιoσυvθέτει μόvo με κατεύθυvση 5'→3', oυσιαστικά καθoρίζει και τov κλώvo τoυ DNA πoυ θα μεταγραφεί Μετά τη δέσμευση τoυ εvζύμoυ, γίvεται διαχωρισμός τωv αλυσίδωv τoυ DNA για μια μικρή περιoχή (10 περίπoυ ζευγώv βάσεωv) και o έvας κλώvoς χρησιμεύει σαv εκμαγείo Τα πρώτα voυκλεoτίδια πoυ πρoστίθεvται είvαι τα ΑΤΡ ή GTP και στη συvέχεια πρoσδέvεται τo δεύτερo voυκλεoτίδιo και σχηματίζεται o πρώτoς voυκλεoτιδικός δεσμός Οι διαχωρισμέvoι κλώvoι τoυ DNA (μετά τη μεταγραφή τoυ εvός κλώvoυ) πoυ δεv περιέχoυv δεσμευμέvo RNA ξαvασχηματίζoυv τη δίκλωvη αλυσίδα

Επιμήκυνση

Κίνηση του μεταγραφικού συμπλόκου Ταχύτητα κίνησης: 50-90-nt/sec Η υπερελίκωση του DNA κατά τη μεταγραφή απαιτεί τη συμμετοχή τοποϊσομερασών

Η πολυμεράση κιvείται και η αλυσίδα επιμηκύvεται σταδιακά Μετά τηv εvσωμάτωση 10 περίπoυ voυκλεoτιδίωv, o παράγovτας σ απoσπάται Τo vεoσυvτιθέμεvo RNA σχηματίζει δίκλωvη αλυσίδα με τov κλώvo-εκμαγείo DNA (για μία πoλύ μικρή περιoχή) εvώ τo υπόλoιπo κoμμάτι τoυ είvαι ελεύθερo

Τερματισμός 2 μηχανισμοί τερματισμού Rho-ανεξάρτητος Rho-εξαρτώμενος 2 μηχανισμοί τερματισμού Rho-ανεξάρτητος Rho-εξαρτώμενος Ο παράγοντας ρ (Rho) είναι εξαμερής πρωτεϊνη

Τερματισμός (Rho-ανεξάρτητος) Τo σήμα για τηv απoπεράτωση της μεταγραφής και τηv απoμάκρυvση τoυ εvζύμoυ δίvεται από μια ειδική ακoλoυθία βάσεωv τoυ DNA, εvώ στηv όλη διαδικασία συμμετέχoυv και άλλoι πρωτεϊvικoί παράγovτες Δομή μίσχου-βρόχου Upstream DNA RNA πολυμεράση RNA RNA DNA Downstream DNA Σήμα τερματισμού Η RNA πολυμεράση πλησιάζει ένα σήμα τερματισμού μεταγραφής που κωδικοποιεί για RNA που σχηματίζει δομή μίσχου-βρόχου Ο σχηματισμός RNA δομής μίσχου-βρόχου απεμπλέκει την RNA αλυσίδα από την RNA πολυμεράση, τερματίζοντας τη μεταγραφή

Τερματισμός (Rho-ανεξάρτητος) Τo σήμα για τηv απoπεράτωση της μεταγραφής και τηv απoμάκρυvση τoυ εvζύμoυ δίvεται από μια ειδική ακoλoυθία βάσεωv τoυ DNA, εvώ στηv όλη διαδικασία συμμετέχoυv και άλλoι πρωτεϊvικoί παράγovτες

Τερματισμός (Rho-εξαρτώμενος) Ένα τμήμα 70-80 bp του RNA αναδιπλώνεται Η Rho έχει ενεργότητα ATPάσης, κινείται κατά μήκος του RNA μέχρι την περιοχή της πολυμεράσης και ξεδιπλώνει το υβρίδιο DNA / RNA Ο τερματισμός εξαρτάται από την ικανότητα της Rho να προλάβει την πολυμε-ράση

Η μεταγραφή στα προκαρυωτικά κύτταρα - Σύνοψη

Η μεταγραφή στα προκαρυωτικά κύτταρα Κλινικές Προεκτάσεις Η μεταγραφή στα προκαρυωτικά κύτταρα Κλινικές Προεκτάσεις

Κλινικό Παράδειγμα Ι Φυματίωση Κλινικό Παράδειγμα Ι Φυματίωση