METODE ZA ISPITIVANJE FUNKCIJA ĆELIJA PRIRODNOG I ADAPTIVNOG IMUNITETA

MTT TEST Vijabilnost ćelija odgovara aktivnosti mitohondrija Kolorimetrijski test: MTT žute boje se u živim ćelijama redukuje u crveno mrki nesolubilni formazan; rastvaranje kristala formazana→ oslobađanje boje, merenje apsorbance

ODREĐIVANJE BROJA I VIJABILNOSTI ĆELIJA Brojanje ćelija na hemocitometru/ elektronski brojač Tripan plavo Metilensko plavo Kristal-violet test Propidijum jodid MTT test

Dobijanje i kultivacija dendritskih ćelija poreklom od monocita (10%FCS/RPMI + GM-CSF i IL-4) (kultivacija, 6 dana) stimulacija različitim Imunomodulatorima, kultivacija -Ekspresija površinskih markera (protočna citometrija) -Procena alostimulatorne sposobnosti MoDC -Produkcija citokina od strane MoDC -Produkcija citokina od strane T-limfocita u ko-kulturi Ispitivanje fenotpiskih i funkcionalnih karakteristika MoDC

METODE ZA ISPITIVANJE FUNKCIJE ĆELIJA PRIRODNOG IMUNITETA FAGOCITI (MAKROFAGI i NEUTROFILI) NK ĆELIJE

FAGOCITI MAKROFAGI NEUTROFILI Produkcija citokina (IL-12, TNFα...) Fagocitoza Produkcija NO i ROS NEUTROFILI Produkti granula (MPO, elastaza, katepsin G...) - Fagocitoza - Produkcija NO, ROS - Produkcija citokina (IL-1, IL-6...)

1. ODREĐIVANJE SPOSOBNOSTI ADHEZIJE Ispitivanje adhezije makrofaga sa i bez prisustva PMA Kratak opsi procedure: - kultivisati ćelije u mikrotitarskoj ploči (5x106 ćelija/bunariću) u četveroplikatima - dodati PMA (samo u polovinu bunarića) ostaviti da se inkubira 60 minuta pa potom ispranjem toplim PBSom ukloniti neadherentne ćelije - fiksirati adherentne ćelije metil-alkoholom (5-7 min) - obojiti ćelije rastvorom metilenskog plavog (10 min) - isprati boju 3x česmenskom vodom - dodati HCl (200μl, 0,1N HCl) - očitati apsorbancu na 650nm

3.ODREĐIVANJE PRODUKCIJE CITOKINA 2.TEST FAGOCITOZE čestice obeležene fluorohromom, fagocitoza se detektuje fluorescentnim mikroskopom/FACS 3.ODREĐIVANJE PRODUKCIJE CITOKINA Vanjćelijska/unutarćelijska detekcija citokina; ELISA testovi, ELISPOT...

4.ODREĐIVANJE PRODUKCIJE ROS-NBT test NADPH oksidaza NBT (oksidovana forma žuta) FORMAZAN (redukovana forma, plav→ sivo-crn) Kolorimetrijski test Intenzitet redukcije NBT-a srazmeran produkciji ROS

5. ODREĐIVANJE PRODUKCIJE NO Griess-ova reakcija (merenje neorganskog nitrita koji je krajnji produkt oksidacije kratkoživećeg NO) 6. ODREĐIVANJE PRODUKCIJE MIJELOPEROKSIDAZE

7. ODREĐIVANJE MIGRACIJE NEUTROFILA (Transwell sistem)

NK ĆELIJE 2. Produkcija citokina (INF-γ) ELISA, ELISPOT Testovi za funkcionalno ispitivanje NK ćelija: 1. Citotoksičnost ( korišćenje tumorskih ćelijskih linija npr. K562 i radioaktivnog 51Cr) 2. Produkcija citokina (INF-γ) ELISA, ELISPOT

METODE ZA ISPITIVANJE FUNKCIJE ĆELIJA ADAPTIVNOG IMUNITETA T limfociti test proliferacije T limfocita in vitro detekcija produkcije citokina test citotoksičnosti B limfociti test proliferacije B limfocita in vitro detekcija produkcije antitela

T LIMFOCITI Test proliferacije Proliferacija stimulisana različitim poliklonskim aktivatorima ili mitogenima limfocita (con A, fitohemaglutimin-PHA,anti-CD3, PMA...) ili specifinim antigenom Proliferativni odgovor se može meriti MTT testom, na osnovu inkorporacije 3H timidina u DNK...

-Izolacija mononuklearnih ćelija -Kultivacija ćelija sa stimulatorom/antigenom 3-5 dana -Pred kraj kultivacije dodavanje radioaktivnog 3H timidina -Merenje radioaktivnosti na sintilacionom brojaču β zračenja

MEŠANA LEUKOCITNA REAKCIJA (MLR) Transplantaciona reakcija Limfociti donora i recipijenta Dvosmerna i jednosmerna MLR

Produkcija citokina (ELISA, RIA, PCR...) ELISPOT

Određivanje citotoksične aktivnosti T limfocita Kokultivacija citotoksičnih T ly sa ciljnim ćelijama (tumorske ćelije,ćelije inficirane virusom itd) koje su obeležene radioizotopom (npr. 51Cr) Nivo oslobođenog radioizotopa je srazmeran citotoksičnom potencijalu ćelija

B LIMFOCITI Test proliferacije Produkcija antitela Isti kao i kod T limfocita (kao mitogen se može koristiti stafilokokni protein A) Produkcija antitela ELISA, RIA, ELISPOT