LÊN MEN RƯỢU TỪ TINH BỘT Seminar Vi sinh thực phẩm GVHD: TS. TRỊNH THỊ HỒNG NHÓM 8: 1. Phạm Thanh Duy 2. Lê Thị Liên

NỘI DUNG Nguyên liệu Vi sinh vật tham gia Các giai đoạn trong quá trình lên men rượu Điều kiện lên men rượu Một số loại rượu từ tinh bột

I. NGUYÊN LIỆU Lúa mì Lúa mạch Lúa mạch đen Bắp Lúa miến Lúa gạo Khoai mì Tinh bột (%) 60 63.2 56-58 62.6 58-63 69.2 Nước (%) 13.2 13.7 15.1 11-12 11 13 Protein thô (%) 11.7 11.8 11.6 8.4 9-12 7.3 0.9 Chất béo thô (%) 2.0 2.2 1.7 3.7 3-4.5 1.2 Xơ thô (%) 5.3 2.1 3 0.5 0.8 Tro (%) 1.6 2.8 1.9 1.5 1.5-3 0.7

Lúa mì Bắp Lúa miến

II. VI SINH VẬT THAM GIA Nấm mốc: thủy phân tinh bột thành đường Nấm men: lên men dịch đường thành rượu Vi khuẩn lactic: acid hóa dịch đường trước khi lên men

2.1. Nấm men Chủ yếu là Saccharomyces cerevisiae Tính chất: Phát triển mạnh trong dịch đường lên men. Tiết ra hệ enzyme nhiều lên men nhanh chóng và hoàn toàn. Lên men được ở nhiệt độ tương đối cao. Chịu được nồng độ cồn cao. Chịu được môi trường có độ acid cao. Nhiệt độ tối ưu: 25-300C

2.1. Nấm men + Môi trường thạch – malt, nước đường hóa - thạch Bảo quản giống nấm men: + Môi trường thạch – malt, nước đường hóa - thạch + 4-10oC, cấy chuyền định kỳ 2 lần/tháng + Dưới lớp dầu parafin hoặc vaselin vô trùng Nuôi cấy nấm men trong quá trình lên men rượu: + Từ thạch nghiêng  bình môi trường100ml, 500ml, 5l, 10l, 100l, 500l, 1000l,… + pH 4,5 - 4,8 + Bình >100l: thổi khí, khuấy trộn môi trường 1-2 giờ, 30-320C, thêm chất sát trùng NaSiF6 (0,02%) + Lên men 65h, sục khí 10h đầu.

2.2. Nấm mốc Aspergillus oryzae, Asp.niger, Asp. usami, Asp. awamori, Asp. baatatae… Tiết hệ enzyme amylase đường hóa các nguồn nguyên liệu tinh bột Aspergillus oryzae: amylase, invertase, maltase, protease và catalase Aspergillus niger : amylase, invectase, protease, maltase, pectinase, glucooxydase Aspergillus awamori và Asp. usami : dextrinase và glucoamylase

2.2. Nấm mốc Nuôi cấy mốc đường hóa: Nuôi cấy chìm: Nuôi cấy mốc trong thùng lên men, thu dịch men có hoạt lực cao, có lắc, khuấy. Nuôi cấy bề mặt: Nuôi cấy mốc trên khay trong các buồng nuôi mốc có điều kiện thích hợp để mốc sinh enzym tối đa, dùng môi trường cám mì

2.3. Vi khuẩn lactic: Bổ sung vào trước quá trình lên men Tạo pH thích hợp lên men rượu Tạo hương cho rượu

III – CÁC GIAI ĐOẠN TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƯỢU Tinh bột 1. Đường hoá Đường 2. Lên men rượu 3. Chưng cất và tinh chế cồn

3.1. Đường hoá Cấu trúc của tinh bột Quá trình đường hóa

Nguồn enzyme: Malt có α-amylase, β-amylase, limit dextrinase, r-enzyme Thực vật: Malt có α-amylase, β-amylase, limit dextrinase, r-enzyme Các enzyme này hoạt động cùng lúc và rất nhanh Đường hóa không hoàn toàn  cần lên men Vi sinh vật: Bacillus licheniformis Bacillus subtili Aspergillus oryzae α- amylase

3.1.2. Các phương pháp đường hóa Bằng acid Men thuốc bắc Maltase Amylo Myco-malt Tác nhân đường hóa - HCl(8–10 %) - H2SO4(2 –5%) Nấm mốc tự nhiên trong thuốc bắc Malt Các loại thóc nảy mầm Amylomyces rouxii, Mucor hay Rhizopus cấy trực tiếp Enzymeamylase của Asp. Oryzae Asp. Niger Asp. Awamori

3.2. Lên men (rượu hóa) Glucose + chất dinh dưỡng Hấp thụ qua bề mặt tế bào nấm men rồi thẩm thấu qua màng bán thấm vào trong tế bào Rượu, CO2 Qua màng tế bào chất, khuếch tán và tan vào môi trường xung quanh

Phương trình tổng quát của lên men: C6H12O6 = 2C2H5OH + 2 CO2 + 2ATP

3.3. Giai đoạn chưng cất Mục đích: Thu được rượu có độ cồn cao hơn Loại bỏ một số tạp chất 2 giai đoạn: Chưng cất thô: tách cồn cùng các chất dễ bay hơi ra khỏi dịch lên men Tinh chế: loại tạp chất ra khỏi cồn thô để thu được cồn tinh khiết

Phân loại tạp chất (dựa vào trọng lượng phân tử, khả năng bay hơi): Tạp chất đầu (rượu đầu, rượu kỹ nghệ) Aldehyde, acetic, ethyl acetate, methyl acetate, rượu metanol Độ sôi thấp hơn rượu etanol Được lấy ra ở giai đoạn đầu của quá trình tinh chế Tạp chất cuối (dầu fusel hay rượu tạp): Rượu cao phân tử: isoamylic, isobutylic… nhiệt độ sôi cao hơn etanol , khó bay hơi, ít hòa tan trong nước Tạp chất trung gian: Ethyl isobutyrate, ethyl isovalerianate. Tùy thuộc, nồng độ rượu và tính chất vật lý của tạp chất

Đặc điểm: Hỗn hợp rượu nước là hỗn hợp đẳng phí (có điểm sôi chung) Tách nước Đặc điểm: Hỗn hợp rượu nước là hỗn hợp đẳng phí (có điểm sôi chung) Phòng thí nghiệm Trong sản xuất lớn Chất háo nước như CaCO3, KCl, CuSO4,… Chưng luyện áp suất thấp (P = 0,0525 atm) Rượu nước không có điểm sôi chung Hiệu suất thu hồi cồn thấp, (60 – 65% so với rượu thô ban đầu) Thu được cồn tuyệt đối.

Chỉ tiêu Rượu tinh khiết dùng trong thực phẩm Trong suốt, không màu, không mùi lạ pH khoảng 6,5 – 7 Hàm lượng etanol 96,5% Furfurol: không có Aldehyde: 6 – 10 mg/l Ester: 30 – 35 mg/l Dầu fusel: 30 – 60 mg/l

3.4. Sự tạo hương trong lên men rượu: - Nguyên nhân: Cơ chất Sản phẩm của quá trình trao đổi chất Giống vi sinh vật trong lên men rượu - 350 hợp chất tạo hương trong rượu - Acid malic  Acid lactic trong lên men rượu được chuyển hóa thành diacetyl, acetone và 2,3-butylen glycol

3.5. Tạp chất Aldehyd Ester Rượu bậc cao Acid Caùc chaát khaùc Al. acetic Formiate ethyl Isopropylic Formic Terpen Al. propionic Acetate ethyl Propylic Acetic Hydrate terpen Al. isobutyric Isobutyrat ethyl Isobutylic Butyric Al. valerianic Acetat methyl Butylic Palmitic Furfural Butyrat ethyl Amylic Acrolein Acetate izoamyl Isoamylic Izoaderianat Izoamyl Methylic Aceton Hexylic Heptylic Octylic Nomilic

Ngộ độc do tạp chất - Rượu methylic Đào thải rất chậm và tích lũy dần dần Trong cơ thể, nó chuyển thành aldehyd formic và axit formic Gây chóng mặt, đau đầu, buồn ngủ và gây nôn. - Rượu tạp (Propylic, buthylic, lzobuthylic, Amylic, Izoamylic): gây độc, mùi khó chịu, gây nôn Aldehyde: Gây nên vị choáng của rượu, bộ máy tuần hoàn, tiêu hoá hoạt động mạnh, huyết áp cao  nhức đầu Hại niêm mạc, đường hô hấp và có thể làm cho tim đập mạnh hay dạ dày bị rối loạn.

IV – ĐIỀU KIỆN LÊN MEN RƯỢU Nhiệt độ pH môi trường Nồng độ đường của dịch lên men Nồng độ O2 môi trường Số lượng men giống Nồng độ CO2 của môi trường Nồng độ etanol Thời gian lên men

Nhiệt độ Tối ưu: 28-320C T0 thấp: khả năng lên men cao, kéo dài, hạn chế tạp khuẩn T0 cao: hoạt tính của nấm men sẽ giảm nhanh, dễ bị nhiễm khuẩn , tạo nhiều ester, aldehyd và tổn thất rượu theo CO2 sẽ tăng pH môi trường Thay đổi điện tích các chất của vỏ tế bào, làm tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấu các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của quá trình lên men pH tối ưu để tạo cồn là 4,5-5,0 pH thích hợp khoảng 4,8-5,2 để đường hóa diễn ra

Nồng độ đường của dịch lên men Thích hợp: 16-18%. Cao: tăng áp suất và mất cân bằng trạng thái sinh lý của nấm men Nồng độ O2 môi trường O2 cần thiết cho sự tăng sinh khối của nấm men trong giai đoạn đầu Giai đoạn lên men cần yếm khí

Nồng độ CO2 của môi trường Số lượng men giống Thích hợp: 10% thể tích thùng lên men Nhiều: tạo rượu nhanh, nhưng chất lượng không tốt Ít: tạo rượu chậm, có thể dễ bị nhiễm và rượu có vị chua Nồng độ CO2 của môi trường Hình thành trong lên men Giảm khả năng sinh sản của nấm men Không làm yếu khả năng lên men của nấm men Kìm chế sự phát triển của những vi sinh vật hiếu khí gây hại

Nồng độ etanol Sản phẩm chính của lên men Ức chế hoạt động của nấm men  Nồng độ cồn tối đa khoảng 14-16%. Thời gian lên men Phụ thuộc nhiều yếu tố Ảnh hưởng nhiều đến chất lượng rượu về mùi, vị, tạp chất,…

V. MỘT SỐ LOẠI RƯỢU Rượu gạo Rượu nếp than Rượu sake Rượu cần

5.1. Rượu gạo

5.2. Rượu whisky Giới thiệu: Whisky: loại rượu phổ biến ở châu Âu và Bắc Mỹ sản xuất chủ yếu từ Scotland, Canada, Ireland và Mỹ. Whisky sản xuất từ bất kì ngũ cốc nhưng ngô, lúa mì, lúa mạch đen và lúa mạch là những loại thường dùng. Có 4 bước chính trong sản xuất whisky, bao gồm: chuẩn bị nguyên liệu, lên men, chưng cất và ủ.

5.2. Rượu whisky (tt) Chuẩn bị nguyên liệu: Ngũ cốc được xay, nghiền, nấu chín và trộn với malt lúa mạch. Lên men: Trong những thùng lên men to được đổ đầy hỗn hợp ngũ cốc và nấm men. Quá trình lên men khoảng 2-4 ngày Chưng cất: Thực hiện trong các bồn chưng cất. Có 2 loại:chưng cất liên tục và chưng cất trong bồn. . Ủ: Whisky chảy qua than hoạt tính sau khi đã ủ trong thùng làm bằng gỗ sồi. Gỗ sồi làm rượu có màu sắc, còn than hấp thu các chất không tinh sạch .Theo thời gian rượu “chín”, đồng nhất về màu sắc và hương vị.

5.3 Rượu nếp than Sản phẩm rượu của Việt Nam được sản xuất bằng phương pháp thủ công từ nguyên liệu là nếp than. Rượu nếp than không qua chưng cất, điểm đặc biệt là sản phẩm cuối gồm dịch lên men lẫn bã lên men được làm nhuyễn Thành phần của rượu ngoài một lượng đường và rượu nhất định còn có một số chất không có ở rượu chưng cất như vitamin (vitamin B1, B2, B12), amino acid (asparagine, lysine, acid glutamic). Có giá trị dinh dưỡng, giúp tiêu hóa tốt.

5.3. Rượu nếp than (tt) Gạo nếp vo sạch, ngâm 3-4 giờ,để ráo, nấu chín để nguội Bổ sung bánh men tỉ lệ 2-3%, trộn đều và cho vào hũ hay vại Trong lên men rượu nếp than, với độ cồn thấp 7-10%, ethanol dễ dàng bị oxy Vì thế sau khi lên men phải bổ sung một lượng rượu tinh khiết, nâng cao nồng độ rượu, tránh oxy hóa rượu làm giảm chất lượng. Sản phẩm cuối cùng có thể ở 2 dạng: Dạng đục: sau khi lên men đem cả khối lên men xay nhuyễn, bổ sung rượu và ủ. Dạng trong: sau khi lên men, xay nhuyễn xác bã, bổ sung rượu. Sau đó đem lọc và thu phần dịch trong đem ủ. Rượu được ủ nơi có nhiệt độ ổn định và mát ít nhất 6 tháng trước khi sử dụng.

5.4. Rượu cần Giới thiệu: Rượu cần là thức uống độc đáo mang đậm bản sắc của người dân tộc miền núi. Lên men theo phương pháp cổ truyền không qua chưng cất, không qua hãm cồn và không sử dụng bã rượu, chỉ sử dụng dịch lên men. Rượu có mùi thơm dịu đặc trưng, vị ngọt, không cay, không đắng. Trong sản xuất rượu cần, người ta dùng vi sinh tự nhiên từ bánh men lá. Nguyên liệu làm bánh men: Gạo và các loại cây lá đặc trưng ở mỗi dân tộc như cây đòng và cây me kà zút (dân tộc K’Ho) hay cây “Bơ hinh ho", "khi mắc cái", củ riềng, lá trầu không, quả ớt (dân tộc Thái); vỏ, lá cây Blakda (dân tộc Banna)…Các loại lá cây này có tính kháng khuẩn, chứa tinh dầu tao hương vị cho rượu. Sự hiện diện của vi sinh vật trong bánh men là do nhiễm từ không khí hay đã có sẵn trên các loại lá cây. Từ bánh men của người dân tộc K’Ho, đã phân lập được: Hai chủng nấm mốc thuộc chi Mucor và Rhizopus và hai chủng nấm men (chưa định danh), một trong hai chủng này vừa có khả năng đường hóa, vừa có khả năng rượu hóa. Với nguồn vi sinh từ tự nhiên như trên nên thành phần vi sinh vật trong bánh men hoàn toàn không ổn định, ảnh hưởng chất lượng của rượu được tạo thành.

5.4. Rượu cần Ché làm rượu rửa sạch, tráng nước sôi, phơi khô. Gạo, bắp mới giã, nấu vừa chín, để nguội và trộn thêm với trấu Trộn bánh men lá vào hỗn hợp cơm - trấu còn ấm theo tỉ lệ 3 bánh men/5kg nguyên liệu bọc lá chuối sạch hoặc cho vào gùi (dưới đáy gùi phải lót sẵn trấu), ủ một đêm gia tăng sinh khối của vi sinh vật trong men. Lựa lá trấu lớn lót bên trong đáy ché, để cơm đã ủ men lên đến cách miệng ché khoảng 10 phân thì ủ một lớp trấu dày. Nhồi tro với nước bịt miệng ché rượu. Sau khoảng 1 tháng rượu dùng được, có mùi thơm nhẹ, vị ngọt đậm, mùi thơm. rượu có sự hài hòa giữa các thành phần acid hữu cơ, cồn, đường và hương thơm. Nồng độ cồn trong rượu cần tương đương hay cao hơn 1-2% so với độ cồn của bia. Ngày nay, men lá không dễ tìm, chất lượng rượu không ổn định, do đó người dân bản xứ đã sử dụng bánh men Trung Quốc hay bánh men sản xuất trong nước

Rượu sake Giới thiệu : Rượu sake là một loại đồ uống lên men của Nhật, được lên men nhờ quá trình lên men rượu dưới tác dụng của nấm men, đường và gạo được chuyển thành rượu. Rượu sake có độ cồn khoảng 15%, có mùi của các ester giống như của chuối và táo chín nẫu. Thành phần của rượu sake bao gồm carbonhydrate (glucose, maltose, sakebiose, panose, polysaccharide.. .), các acid vô cơ (acid succinic, acid lactic, acid fumaric, v.v...) và một số acid amin như arginine, valine, alanine, prolin,… 5 nhân tố quan trọng trong sản xuất rượu sake: nước, gạo, kỹ thuật, men, thổ nhưỡng/ khí hậu. Quy trình ủ rượu sake chung: gạo được rửa và nấu chín, trộn với nấm men và koji (koji là gạo nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae). Hỗn hợp được lên men, bổ sung thêm gạo, koji và nước 3 đợt trong 4 ngày. Sự lên men thực hiện trong một thùng to gọi là shikomi. Hỗn hợp được ủ 18-32 ngày sau đó rượu được ép, lọc và pha trộn

Rượu sake (tt) Chuẩn bị gạo: Gạo cần có hàm lượng tinh bột cao được tách vỏ trấu, xát cho tới khoảng 65% chỉ còn lại phần trung tâm hạt nhiều tinh bột; rửa bằng nước đã loại bỏ Fe và Mn và ngâm. Hấp gạo: Gạo được hấp chín trong một cái “chõ” gọi là koshiki chia làm 2, một phần rắc nấm mốc (A. oryzae). Làm mốc : phần quan trọng của toàn bộ quá trình ủ rượu. Nấm mốc phát triển trong tối. Bào tử nấm mốc được rắc lên gạo đã hấp để nguội. Sau 36-45 giờ, kiểm tra koji, trộn và bảo quản. Koji được sử dụng ít nhất 4 lần trong suốt quá trình ủ rượu. Sự lên men: Koji, gạo hấp và nấm men thuần khiết được trộn lẫn. Sau khoảng 2 tuần, mật độ tế bào nấm men có thể đạt 100 triệu tế bào trong khoảng 1 muỗng cafe. Ủ rượu : Sau khi chuyển sang thùng ủ lớn hơn, gạo, koji và nước tiếp tục được bổ sung 3 lần trong vòng 4 ngày với lượng gấp đôi mẻ ủ. Đây là lần ủ chính, sau khi lên men 18-32 ngày

Ép rượu: sake được ủ sau lên men, ép bỏ cặn và phần không lên men, thu lấy phần dịch lỏng là sake. Lọc: Dịch lỏng sau thu nhận để yên 10 ngày rồi lọc qua than hoạt tính để ổn định hương vị và màu sắc. Khử trùng: rượu sake được khử trùng nhanh bằng cách cho chảy qua một đường ống ngâm trong nước nóng 60-65oC. Sake không khử trùng gọi là namazake phải được bảo quản ở nhiệt độ lạnh. Sự “chín” rượu: Cuối cùng sake được ủ khoảng 6 tháng nhằm tăng hương thơm đồng thời làm giảm mùi hăng. Trước khi vô chai sake được giảm độ cồn 20% xuống khoảng 16% và được khử trùng lần 2 ở giai đoạn này. Những thay đổi trong quá trình lên men: Hơn 1 thế kỉ trước, lên men rượu theo tự nhiên đã được thay đổi làm chất lượng sake tốt hơn. Một ưu điểm là cải tiến thiết bị xát gạo được thực hiện nhanh chóng với chất lượng gạo sau mài xát ổn định.

Một số loại rượu sake Về cơ bản có 5 loại sake: junmai-shu chỉ dùng gạo và không thêm rượu chưng cất honjozo-shu có thêm một ít rượu chưng cất ginjo-shu gạo được cán, có hay không có thêm rượu daiginjo-shu gạo được cán nhừ, có hay không có thêm rượu nama-zake sake không hấp pasteur và cơ bản khác với 4 cách trên. Ngoài ra, còn có các loại sake khác: Nigori-zake,Yamahai-shikomi và Kimoto

VI. TIÊU CHUẨN RƯỢU TRẮNG CHƯNG CẤT TCVN 7043 : 2002 Trong tiêu chuẩn này áp dụng định nghĩa sau: Rượu trắng (Distilled alcoholic beverages) là đồ uống có cồn được chưng cất từ dịch lên men có nguồn gốc tinh bột, đường, hoặc được pha chế từ cồn thực phẩm và nước. Yêu cầu về nguyên liệu Yêu cầu cảm quan Chỉ tiêu hóa học Giới hạn hàm lượng kim loại nặng

Xin chân thành cảm ơn cô và các bạn!