ΑΜΕΣΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΒΙΟΛΟΓΙΚΟΥ ΣΗΜΑΤΟΣ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΗΣΗ – ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΜΑΤΑ - ΧΡΩΣΕΙΣ Γ. Καπαρός, Επίκουρος Καθηγητής Μικροβιολογίας, Αρεταίειο Νοσοκομείο

ΒΙΟΛΟΓΙΚΟ ΣΗΜΑ Κατά τη διάρκεια ενός βιολογικού γεγονότος που συνδέεται με ηλεκτρική – χημική ή μηχανική δραστηριότητα (χωρικά – χρονικά ή χωροχρονικά) παράγονται συχνά σήματα που μπορεί να μετρηθούν και να αναλυθούν. Τα βιολογικά σήματα επομένως περιέχουν πληροφορίες που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να εξηγήσουν τους φυσιολογικούς μηχανισμούς που υποκρύπτονται σε ένα συγκεκριμένο βιολογικό γεγονός ή ένα σύστημα. Βιολογικό σήμα μπορεί να αποκτηθεί με ποικίλους τρόπους, π.χ. από το στηθοσκόπιο που χρησιμοποιεί ο γιατρός για να ακούσει τον ήχο της καρδιάς ενός ασθενή ή με τη χρήση ιδιαίτερα σύνθετων και τεχνολογικά προηγμένων βιοϊατρικών οργάνων όπως καρδιογράφος.

ΑΜΕΣΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΒΙΟΛΟΓΙΚΟΥ ΣΗΜΑΤΟΣ ΚΑΤΗΓΟΡΙΕΣ ΣΗΜΑΤΩΝ Βιοηλεκτρικά σήματα: ηλεκτροεγκεφαλογράφημα – ηλεκτρομυελογράφημα – ηλεκτροκαρδιογράφημα. Βιομαγνητικά σήματα: Μαγνητική τομογραφία. Βιοχημικά σήματα: Μέτρηση με αναλυτή ιόντων Ca – K. Εμβιομηχανικά σήματα: Μέτρηση πίεσης αίματος. Βιοακουστικά σήματα: Μέτρηση ακουστική του σήματος που παράγει η λειτουργία μιας καρδιακής βαλβίδας. Βιοοπτικά σήματα: Παράγονται από τις οπτικές ιδιότητες των βιολογικών συστημάτων. Τα βιοοπτικά σήματα μπορούν να εμφανισθούν χρησιμοποιώντας μια βιοιατρική τεχνική, π.χ. κυτταρική διαφορική χρώση (xρώση Gram) και μικροσκόπηση. Στην περίπτωση αυτή έχουμε: ΑΜΕΣΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΒΙΟΛΟΓΙΚΟΥ ΣΗΜΑΤΟΣ

ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΗΣΗ Για την μελέτη των περισσοτέρων από τους οργανισμούς που αφορούν τη Μικροβιολογία το σύνθετο φωτονικό μικροσκόπιο και οι παραλλαγές του αποτελούν ένα εξαιρετικό εργαλείο.

Σύνθετο Φωτονικό Μικροσκόπιο

Η ΔΙΑΚΡΙΤΙΚΗ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑ (ΑΝΑΛΥΣΗ) ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΗΣΗ Η ΔΙΑΚΡΙΤΙΚΗ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑ (ΑΝΑΛΥΣΗ) ενός μικροσκοπίου αναφέρεται στη δυνατότητα του να διακρίνει λεπτομέρειες στη δομή των κυττάρων. Το γεγονός αυτό σχετίζεται με την ικανότητα που έχουν οι φακοί να διακρίνουν δύο σημεία που απέχουν όσο το δυνατόν λιγότερο μεταξύ τους ενώ βασικό ρόλο παίζει το μήκος κύματος του φωτός που χρησιμοποιείται. ΣΥΝΕΠΩΣ

ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΗΣΗ Επειδή το μήκος κύματος του ορατού φωτός κυμαίνεται από 400-800nm η διακριτική ικανότητα του κοινού μικροσκοπίου περιορίζεται σε αντικείμενα διαμέτρου το πολύ 200nm (0,2μm). Για το λόγο αυτό το κοινό μικροσκόπιο δεν μπορεί να οπτικοποιήσει την εσωτερική δομή των περισσοτέρων βακτηριακών κυττάρων και χρησιμεύει μόνο για την μελέτη του σχήματός τους, της διάταξής των κυττάρων τους και του τρόπου που χρωματίζονται με τις διάφορες χρώσεις. Η συνήθης μέγιστη μεγέθυνση που μπορούμε να επιτύχουμε είναι (1000x) ενώ σε ειδικές περιπτώσεις η μεγέθυνση μπορεί να φτάσει (2000x).

ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΗΣΗ Για να λάβουμε μια σαφή λεπτομερή εικόνα από ένα σύνθετο φωτονικό μικροσκόπιο τα παρατηρούμενα αντικείμενα πρέπει να εμφανίζουν αντίθεση με το μέσο τους (την ουσία στην οποία είναι τοποθετημένα). Για να επιτύχουμε αυτήν την αντίδραση, πρέπει να μεταβάλλουμε τον δείκτη διάθλασης των δειγμάτων από τον δείκτη διάθλασης του μέσου. Ο ΔΕΙΚΤΗΣ ΔΙΑΘΛΑΣΗΣ είναι το μέτρο της δυνατότητας κάμψης των αχτίδων του φωτός ενός υλικού. Ένας τρόπος μεταβολής του δείκτη διάθλασης των παρατηρούμενων δειγμάτων είναι ο χρωματισμός των δειγμάτων με ειδικές χρωστικές. Έτσι οι ακτίνες φωτός που περνούν από το κεχρωσμένο δείγμα θα ακολουθήσουν διαφορετική πορεία από αυτές που περνούν από το μέσο. Η ελαφρώς διαφορετική πορεία των δύο ακτίνων συλλέγεται και μεγεθύνεται από τους αντικειμενικούς φακούς.

ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΗΣΗ Για να διατηρήσουμε την πορεία των ακτίνων μετά την έξοδό τους από το δείγμα και μέχρι να περάσουν στον αντικειμενικό φακό (100x) τοποθετούμε ειδικό έλαιο μεταξύ της αντικειμενοφόρου πλάκας και του αντικειμενικού φακού.

ΔΙΑΦΟΡΟΙ ΤΥΠΟΙ ΦΩΤΟΝΙΚΩΝ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΩΝ ΧΡΗΣΙΜΟΤΗΤΑ: Χρησιμοποιείται το ορατό φως ως πηγή φωτισμού των δειγμάτων. Δεν μπορεί να διακρίνει δομές μικρότερες από 0,2μm. Το δείγματα εμφανίζεται σε φωτεινό περιβάλλον. Φθηνό και εύκολο στη χρήση Φωτεινού πεδίου ΚΥΡΙΑ ΧΡΗΣΗ: Για παρατηρήσεις βαμμένων δειγμάτων και για μέτρηση μικροβίων. Δεν μπορεί να διακρίνει πολύ μικρά δείγματα όπως οι ιοί.

ΔΙΑΦΟΡΟΙ ΤΥΠΟΙ ΦΩΤΟΝΙΚΩΝ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΩΝ ΧΡΗΣΙΜΟΤΗΤΑ: Χρησιμοποιεί ένα ειδικό συγκεντρωτικό φακό με δακτυλιοειδές διάφραγμα. Το διάφραγμα επιτρέπει τη δίοδο του φωτός που εστιάζεται άμεσα στο δείγμα και σε μια πλάκα διάθλασης στον αντικειμενικό φακό. Οι άμεσες και οι διαθλώμενες ακτίνες συγκεντρώνονται στους προσοφθάλμιους φακούς για να σχηματίσουν την εικόνα του αντικειμένου. Δεν απαιτούνται χρώσεις. Αντίθεσης Φάσης ΚΥΡΙΑ ΧΡΗΣΗ: Διευκολύνει τη λεπτομερή εξέταση εσωτερικών δομών ζωντανών δειγμάτων.

ΔΙΑΦΟΡΟΙ ΤΥΠΟΙ ΦΩΤΟΝΙΚΩΝ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΩΝ Σκοτεινού Πεδίου ΧΡΗΣΙΜΟΤΗΤΑ: Χρησιμοποιεί έναν ειδικό συγκεντρωτικό φακό με ένα διάτρητο διάφραγμα που εμποδίζει το φως να περάσει απ’ευθείας στον αντικειμενικό φακό. Το φώς ανακλάται από το δείγμα και εισέρχεται στον αντικειμενικό φακό. Το δείγμα φαίνεται φωτεινό σε σκούρο υπόβαθρο. ΚΥΡΙΑ ΧΡΗΣΗ: Για παρατηρήσεις ζωντανών μικροοργανισμών που δεν είναι ορατοί με το μικροσκόπιο φωτεινού πεδίου, δεν βάφονται ή διαταράσσονται από τη χρώση. Χρησιμοποιείται συχνά για τη διάγνωση σύφιλης.

ΔΙΑΦΟΡΟΙ ΤΥΠΟΙ ΦΩΤΟΝΙΚΩΝ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΩΝ Η ΑΡΧΗ ΤΟΥ ΑΝΟΣΟΦΘΟΡΙΣΜΟΥ Ένας τύπος φθοριοχρώματος συνδυάζεται με αντισώματα έναντι ενός συγκεκριμένου τύπου βακτηρίων . Όταν το μίγμα αυτό προστίθεται σε βακτηριακά κύτταρα σε αντικειμενοφόρο πλάκα, τα αντισώματα συνδέονται με τα βακτηριακά κύτταρα και τα κύτταρα φθορίζουν όταν φωτίζονται με υπεριώδες φώς. ΑΝΤΙΣΩΜΑ

ΔΙΑΦΟΡΟΙ ΤΥΠΟΙ ΦΩΤΟΝΙΚΩΝ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΩΝ Φθορισμού Στη δοκιμασία απορρόφησης φθοριζόντων τρεπονηματικών αντισωμάτων (FTA-ABS) για τη σύφιλη, τα κύτταρα του Treponema pallidum εμφανίζονται πράσινα σε σκοτεινό υπόβαθρο.

ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΓΙΑ ΦΩΤΟΝΙΚΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ - ΧΡΩΣΕΙΣ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΓΙΑ ΧΡΩΣΗ Στρώνουμε λεπτή στρώση μικροοργανισμών στην αντικειμενοφόρο πλάκα. Ξήρανση στον αέρα. Μονιμοποίηση μικροβίων με ζέσταμα της αντικειμενοφόρου πλάκας πάνω σε φλόγα. Εφαρμογή χρωστικής. Ξέπλυμα με H2O.

ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΓΙΑ ΦΩΤΟΝΙΚΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ - ΧΡΩΣΕΙΣ ΘΕΤΙΚΟ ΙΟΝ ΧΡΩΣΤΙΚΕΣ = ΑΛΑΤΑ ΑΡΝΗΤΙΚΟ ΙΟΝ Βασικές Χρωστικές: Το χρώμα τους βρίσκεται στο θετικό ιόν (χρωμοφόρο). Κρυσταλλικό ιώδες Κυανούν του μεθυλενίου. Πράσινο μαλαχίτη Σαφρανίνη Έλκονται από τα ελαφρώς αρνητικά φορτισμένα βακτήρια (pH ≈ 7) και τα χρωματίζουν

ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΓΙΑ ΦΩΤΟΝΙΚΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ - ΧΡΩΣΕΙΣ Όξινες Χρωστικές: Το χρώμα τους βρίσκεται στο αρνητικό ιόν (χρωμοφόρο). Ηωσίνη Φουζίνη Νιγροσίνη Η χρωστική χρωματίζει το υπόστρωμα και καλείται ΑΡΝΗΤΙΚΗ ΧΡΩΣΗ.

ΚΑΤΗΓΟΡΙΕΣ ΧΡΩΣΕΩΝ

ΧΡΩΣΗ Gram (Διαφορική Χρώση)

Ziehl – Neelsen ΔΙΑΦΟΡΙΚΗ ΧΡΩΣΗ ΟΞΕΑΝΤΟΧΗ ΧΡΩΣΗ Ziehl – Neelsen ΔΙΑΦΟΡΙΚΗ ΧΡΩΣΗ

ΕΙΔΙΚΕΣ ΧΡΩΣΕΙΣ

ΑΡΝΗΤΙΚΗ ΧΡΩΣΗ ΕΛΥΤΡΩΝ ΕΛΥΤΡΟ - ΓΛΥΚΟΚΑΛΥΚΑΣ Ουσία που εκκρίνεται από το κύτταρο και το περιβάλλει. Ιξώδες ζελατινούχο πολυμερές αποτελούμενο από πολυσακχαρίτες ή πολυπεπτίδια ή και τα δύο. Εάν είναι σταθερά συνδεδεμένος με το κυτταρικό τοίχωμα ονομάζεται κάψα και σε ορισμένα είδη είναι σημαντική για την βακτηριακή τοξικότητα αφού προστατεύουν τα παθογόνα βακτήρια από την φαγοκυττάρωση από τα κύτταρα του ξενιστή: Streptococcus pneumoniae (πνευμονία) Klebsiella pneumoniae (Λοιμώξεις αναπνευστικού) Streptococcus mutans (Τερηδόνα)

ΧΡΩΣΗ ΕΝΔΟΣΠΟΡΙΩΝ (Schaeffer – Fulton) ΕΝΔΟΣΠΟΡΙΑ Εξειδικευμένα αδρανή κύτταρα κυρίως Gram (+) βακτηρίων. Είναι ανθεκτικά αφυδατωμένα κύτταρα με παχιά τοιχώματα στο εσωτερικό της βακτηριακής κυτταροπλασματικής μεμβράνης. Επιζούν σε ακραίες θερμοκρασίες, σε τοξικές ουσίες, στην ακτινοβολία και σε συνθήκες έλλειψης νερού. Ενδοσπόρια ηλικίας 45 εκατομμυρίων ετών που βρέθηκαν στο πεπτικό σύστημα απολιθωμένων εντόμων σε ρητίνες, βλάστησαν όταν τοποθετήθηκαν σε θρεπτικά υλικά.