Organi i ćelije imunskog sistema

Primarni limfoidni organi: kostna srž i timus => Razvoj limfocita, selekcija i sazrevanje. Sekundarni limfoidni organi: Limfni čvorovi i slezina => Aktivacija limfocita i nastanak efektorskih ćelija

1. Mesto nastanka svih imunskih i krvnih ćelija Kostna srž 1. Mesto nastanka svih imunskih i krvnih ćelija <= Hematopoetske stem ćelije 2. Obezbeđuje interakciju ćelija-ćelija i citokine za razvoj svih imunskih ćelija. <= Stromalne retikularne ćelije i druge ćelije

Hematopoeza

Timus Mesto gde T ćelije sazrevaju 2. Medijastinum 3. Više lobulusa => svaki ima Spoljašnji korteks => gusti T Ly Unutrašnja medula => raštrkani T Ly Druge ćelije: timusne epitelne ćelije, DC, Makrofagi => Interakcije ćelija-ćelija i citokini 4. Involucija timusa

Timus Pozitivna selekcija Negativna selekcija

Limfni čvorovi (LČ) LČ => mali nodularni organi => smešteni po celom telu => Aktivacija limfocita Limfociti => Segregiraju u različite delove LČ Spoljašnji korteks => B ćelijska zona (folikul) => Germinativni centri (sekundarni folikuli) => aktivacija B ćelija Unutrašnji region, parakorteks => T ćelijska zona

Limfni čvorovi (LČ) Skupovi limfnih čvorova strateški su raspoređeni u oblastima kao što su vrat, aksile, prepone, mediastinum i abdominalana šupljina, koji dreniraju površinske i dublje regione tela. Filtri za Ag. * Somatski LČ su površinski - štite kožu * Visceralni LČ su dublji - štite mukozu parakorteks kapsula T limfociti i dendritske antigen prezentujuće ćelije medulа eferentni limfni sud germinativni centar aferentni limni sud primarni limfni folikuli sekundarni limfni folikul HEV korteks * nekoliko aferentnih limfnih sudova, jednog eferentnog limfni sud Put cirkulacije Ly kroz LČ je sledeći: aferentni limfni sud – limfni čvor – aferentni sinusoidi korteksa i parakorteksa – sinusoidi medule – eferentni sabirni limfatikusi – glavni eferentni sud ductus thoracicus.

Limfni sistem Veza sa sistemskom cirkulacijom/krvotokom

Slezina 1. Najveći limfoidni organ, u gornjem levom kvadrantu abdomena 2. Mesto imunskog odgovora na antigene iz krvi => filter za krv 3. * Bela pulpa => T i B ćelijske zone * Marginalna zona (MZ) * Crvena pulpa (RP) 4. T ćelije => periarterijalni limfoidni omotač (PALS) B ćelije => folikuli => marginalna zone

Limfna tkiva pridružena mukozi MALT (Mucosa associated lymphoid tissue) imunski sistem mukoze GIT (GALT) imunski sistem mukoze respiratornog trakta (BALT) imunski sistem mukoze urogenitalnog trakta Organizovano limfoidno tkivo (Pejerove ploče, tonzile) Difuzno limfoidno tkivo (DĆ kože, intraepitelni T limfociti)

Ćelije imunskog sistema 1. Limfociti 2. Nelimfoidne (akcesorne ćelije) CD2+LFA1+ B limfociti T limfociti NK ćelije (Natural killer) Makrofagi Dendritske ćelije Granulociti: - neutrofili - bazofili - eozinofili Epitelne ćelije timusa Stromalne ćelije kostne srži i dr.

Limfociti Neaktivni limfociti slična morfologija 8-10 μm velikim heterohromatinskim jedrom malo citoplazme sa malobrojnim organelama Funkcionalno limfociti su veoma heterogena grupa ćelija sa različitim fenotipom, funkcijama i sa sposobnošću razvoja kompleksnih bioloških odgovora i aktivnosti. Ključne imunokompetentne ćelije (B- i T-limfociti) adaptivnog imuniteta sa receptorom za antigen

Klase limfocita B limfociti - humoralni adaptivni imunski odgovor T limfociti - ćelijski adaptivni imunski odgovor CD4+ pomoćnički T limfociti CD8+ citolitički/citotoksični T limfociti Ćelije prirodne ubice (engl. natural killer cells, NK ćelije) - prirodni imunitet

Antigen prezentujuće ćelije Imaju sposobnost hvatanja, prerade i prikazivanja antigena u odgovarajućem obliku limfocitima Profesionalne APĆ – drugi signal za aktivaciju limfocita Dendritske ćelije Makrofagi B limfociti

Dendritske ćelije (DĆ) Specijalizovane ćelije za ingestiju antigena i njihovu prezentaciju limfocitima Karakteristike:- sposobnost fagocitoze - sposobnost migracije - prerada proteinskih antigena do peptida - prepoznavanje “opasnih signala” - karakteristični površinski molekuli - polarizacija citokinskog profila - aktivacija efektorskih funkcija B limfocita, NK ćelija - regulacija imunskog odgovora indukcijom tolerancije Prekurskori DC nastaju diferencijacijom CD34+ matičnih ćelija poreklom iz kostne srži Lokalizacija: limfoidni organi- u oblastima bogatim T Ly (najpotentniji stimulatori T ćelijskog odgovora) nelimfoidna tkiva- nisu sposobne da stimulišu T ćelijski odgovor, dok se ne aktiviraju i ne migriraju u limfoidno tkivo

Makrofagi (MF) Jedan od tri tipa fagocita imunskog sistema Nastaju od monocita iz krvi - migracijom u tkivo monociti se diferenciraju u tkivne makrofage Funkcije: - produkcija citokina (IL-1, IL-6, TNF...) - fagocitoza - uništavanje mikroba: a) oksidativni mehanizmi (ROS, NO), b) neoksidativni mehanizmi (proteaze granula)

Granulociti – polimorfonuklearni leukociti (PMN) 1- Neutrofili- najveći deo granulocita; prvi stižu na mesto infekcije; fagociti; prirodni imunitet * Imaju sposobnost prepoznavanja, ingestije i uništavanja MO posredstvom reaktivnih kiseoničnih i azotnih intermedijera i enzima smeštenih u specijalizovanim granulama * Imaju sposobnost i produkcije citokina 2- Eozinofili- potpuno diferentovani PMN lokalizovani u submukoznim tkivima. * Učestvuju u stanjima specifičnih imunskih reakcija, uključujući alergijske bolesti, i grupišu se u zoni inkriminisanog tkiva. 3- Bazofili- diferenciraju se i sazrevaju u kostnoj srži, a potom migriraju u cirkulaciju.

Mast ćelije (mastociti) Velike ovalne ćelije vezivnog tkiva Plazma ispununjena bazofilnim granulama Hematopoetskog su porekla Nezrele ćelije migriraju u ciljna tkiva Lokalizacija: koža, mukoza, prokrvljena tkiva U odgovoru na spoljašnje stimuluse oslobađaju različite biološki aktivne supstance (histamin, proteolitičke enzime...)

ORGANI IMUNSKOG SISTEMA Izolovanje limfoidnih organa pacova (slezine, timusa i limfnih čvorova) Maceracija i filtracija tkiva Priprema ćelijske suspenzije Brojanje ćelija Postavka ćelijske kulture

DISEKCIJA I IZOLACIJA ORGANA

Mezenterični limfni čvorovi Timus Mezenterični limfni čvorovi Slezina

ODREĐIVANJE BROJA ĆELIJA U SUSPENZIJI Bojenje ćelija vitalnom bojom (TRIPAN PLAVO) Mrtve ćelije plave Nanošenje suspenzije na hemocitometar Posmatranje i brojanje ćelija pod mikroskopom Određivanje broja ćelija po ml ćelijske suspenzije

Ćelije se broje u sva četiri velika kvadrata, nađe se srednja vrednost koja se množi sa razblaženjem i sa 104 kako bi se broj ćelija izrazio po ml ćelijske suspenzije Ivica većeg kvadrata (A-D) =1 mm Dubina = 0,1mm V većeg kvadrata =0,1mm3 0,1mm3 x 104 = 1 cm3= 1 ml

Zadatak 1 Nakon izolacije ćelija iz slezine/timusa/limfnih čvorova napravliti ćelijsku suspenziju i odrediti broj ćelija po ml suspenzije. Postaviti ćelije u mikrotitarsku ploču sa 96 bunarića u cilju ispitivanje njihovih odgovora na različite koncentracije test supstance A (A1-A5) u prisustvu lili odsustvu LPS-a kao stimulator Zapremina u svakom bunariću treba da bude 200 µl (100 µl ćelija + 50 µl LPS-a + 50 µl test supstance A odgovarajuće koncentracije). Radi se u četvoroplikatima. Napomena: zapremina u bunarićima u koje ne dodajete LPS je takođe 200 µl ali umesto 50 µl LPS dodajete PBS u kome ste pravili suspenziju. Broj ćelija/bunariću = 104; conc. LPS = 50 ng/ml kulture; štok LPS =1μg/ml; štok supstance A =1mM/L

CITOSPIN PREPARAT May-Grünwald-Giemsa Sušenje preparata, provera Bojenje (MGG) Sušenje i montiranje pokrovnog stakla Analiza preparata May-Grünwald-Giemsa

May-Grünwald-Giemsa Citospin preparati se preliju May-Grünwald rastvorom i inkubiraju 5 minuta Po isteku inkubacije, preparati se isperu destilovanom vodom i potom tretiraju Giemsa rastvorom (razblaženja 1:10 u destilovanoj vodi) Nakon inkubacije, preparati se ponovo ispiraju destilovanom vodom a zatim se osuše na sobnoj temperaturi i montiraju se pokrovna stakla.