Laboratorijska dijagnostika monoklonskih gamapatija Danica Matišić

NALAZU MONOKLONSKOG IMUNOGLOBULINA U SERUMU I/ILI URINU DIJAGNOZA MONOKLONSKIH GAMAPATIJA OSNIVA SE NA NALAZU KLASIČNOG TRIJASA: NALAZU MONOKLONSKOG IMUNOGLOBULINA U SERUMU I/ILI URINU INFILTRACIJE KOŠTANE SRŽI PLAZMA STANICAMA (>10%) OSTEOLITIČKIH ŽARIŠTA IMUNOKEMIJSKU METODU ZA ODREĐIVANJE RAZREDA I TIPA MONOKLONSKOG IMUNOGLOBULINA, PRVI PUT OPISALI SU GRABAR I WILLIAMS 1953.GOD.

Laboratorijska dijagnostika obuhvaća: elektroforezu proteina, ukup.prot. Ig GAM,IF,β2m, kreatinin i Ca u serumu,te BJP u serumu i/ili urinu,SE,KKS

LABORATORIJSKA EVALUACIJA MONOKLONSKOG PROTEINA Robert A, Kyle, David F. Keren,Raymond Alexanian,Usha Kallemuchikkal 1. Elektroforeza proteina u serumu i urinu: nisko rezolucijske elektroforeze (2g/l) visoko rezolucijske elektroforeze (1g/l)* 2. Kvantitativno određivanje imunoglobulina Nefelometrijski ili turbidimetrijski* Radijalna imunodifuzija 3. Definiranje razreda i tipa monoklonskog imunoglobulina Imunofiksacija* Imunoelektroforeza Imunoselekcija Imunosupstrakcija: moguća samo uz kapilarnu elektroforezu 4. Kvantitativno određivanje monoklonske komponente Denzitometrijski 5. Kontrola kvalitete evaluacije monoklonskog proteina Ključna komponenta interne kontrole: direktan kontak biokemičara s kliničarem o slučaju koji je neuobičajene prirode ili ako postoji bilo koja diskrepansa u nalazu

Imunofiksacija Imunoelektroforeza DIJAGNOSTIČKI ALGORITAM ZA DEFINICIJU MONOKLONSKOG PROTEINA Vizualni pregled Bez promjena Bence Jones protein? Klinička sumnja ili prisutnost monoklonske vrpce Imunofiksacija i/ili imunoelektroforeza Elektroforeza proteina u mokraći (100 x ukonc. uzorak) Definicija M-P (određ. razreda i tipa) Negativ. nalaz Prisutan BJ protein Denzitometrijska kvantifikacija M-P Opisni nalaz + klinička informacija daju tumačenje nalaza Elektroforeza serumskih proteina KROHEM SKUPINA Pododbor za laboratorijsku hematologiju i morfologiju IMUNOKEMIJA: D. Matišić, V. Preden-Kereković Imunofiksacija Imunoelektroforeza

SL0BODNI LAKI LANCI - BJP serumska konc.SLL korelira samo s aktivnošću koštane srži, što znači da njihov nalaz može biti neovisan biljeg monoklonskih gamapatija jedan posebno važan aspekt SLL je njihov kratak poluživot: 2-3 sata za kapu i 5–6 sati za lambdu; što je 150 x kraće vrijeme od 21 dana koliko je poluživot IgG molekule tako konc. slobodnih lakih lanaca omogućuje vrlo brzo procjenu učinka kemoterapije: 92-128 dana brže nego konc. M Ig bolesnici koji su prema nalazu intaktnog M Ig, u remisiji mogu još uvijek imati povišenu konc. SLL što indicira ostatnu bolest koristeći isti argument, bolesnici čija konc SLL počinje rasti nakon modernog intenzivnog tretmana ide u prilog relapsu bolesti

A.R. Bradwell: Free Light Chain Assay Razvoj Free Light Chain reagensa za kvantitativno određivanje slobodnih lakih lanaca, SLL, kapa (κ) ili lambda (λ) tipa, otvorio je mogućnost njihovih aplikacija i povećao njihovu kliničku važnost Refer. interv.: SLL κ mg/l Refer. interv.: SLL λ Refer. interv. κ/λ SERUM 3,30 – 19,40 5,71 – 26,3 0,26 – 1,65 URIN 1,35 – 24,19 0,24 – 6,66 2,04 – 10,37

KROHEM SKUPINA Pododbor za laboratorijsku hematologiju i morfologiju IMUNOKEMIJA: D. Matišić, V. Preden-Kereković Vizualni pregled Bez promjena Bence Jones protein? URIN I SERUM Klinička sumnja ili prisutnost monoklonske vrpce Imunofiksacija i/ili imunoelektroforeza Definicija M-P (određ. razreda i tipa) Denzitometrijska kvantifikacija M-P Opisni nalaz + klinička informacija daju tumačenje nalaza Elektroforeza serumskih proteina FREELITE™ : SLLκ, SLLλ + κ/λ Elektroforeza proteina u mokraći (100 x ukonc. uzorak) Negativ. nalaz Prisutan BJ protein Imunofiksacija i/ili imunoelektroforeza Kod bolesnika s multiplim mijelomom, Waldenström makroglobulinemijom i amiloidozom potrebno je pratiti promjene u koncentraciji M-proteina svakih 1-2 mj dok je kod MGNZ dovoljno je: 1 x u godini DIJAGNOSTIČKI ALGORITAM ZA DEFINICIJU MONOKLONSKOG PROTEINA

SLL I BUBREŽNO OŠTEĆENJE: Paul W. Sanders Nakon filtracije SLL se vežu na heteromerične receptore koji se sastoje od kubilina i megalina i time injiciraju reapsorpciju u proksimalne tubule. Poslije endocitoze, SLL budu hidrolizirani i vraćeni kao AK u cirkulaciju SLL su otrovni: zbog potencijalnih interakcija sa svim dijelovima nefrona; Nefrotoksični potencijal SLL je ovisan o njihovoj fizikalno kemijskoj kompoziciji kao i utjecaju okoliša u kojem se nalaze Ovi faktori određuju tip i težinu oštećenja bubrega Laki lanci uzrokuju intracelularni oksidativni stres (NFκB,MCP1; varijabilna domena lakog lanca daje interakciju s THP...) Paraproteinemijske bubrežne bolesti dijelimo na primarne glomerularne i posljedične tubulo intersticijske bolesti. Odlaganje SLL je direktno odgovorno za patološke procese tubulo intersticijskog oštećenja.

u tim slučajevima rezultat SLL u urinu biti će nepouzdan Koncentracija slobodnih lakih lanaca Ig ovisi o produkciji plazma stanica i bubrežnom klirensu. Kod nekih bolesnika s monoklonskom gamapatijom količina SLL ostaje ispod reapsorpcionog kapaciteta bubrega tako će abnormalna konc. serumskih SLL biti nedetektibilna u urinu u tim slučajevima rezultat SLL u urinu biti će nepouzdan Katzmann JA. i Hill P.G.(Mayo Clinic) pokazali su na velikom broju bolesnika, u dvije odvojene studije, da zbog oštećenja bubrega (približno 25 % bolesnika s monoklonskim gamapatijama) možemo naći lažno pozitivne nalaze SLL u serumu odnosno lažno negativne u urinu. Uz poliklonsku sintezu imunoglobulina i/ili bubrežnog oštećenja, naći ćemo 10 – 20x povećanu sintezu lakih lanaca u serumu Bubrežna ekskrecija SLL raste s koncentracijom u serumu ali značajno opada kada je visoka koncentracija kombinirana s bubrežnim oštećenjem.

Skupljanje 24 satnog urina je : mukotrpno za bolesnike i uglavnom netočno; -laboratorijski postupak evaluacije monoklonskog proteina se znatno produljuje Stoga mnogi kliničari sugeriraju da se 24 satni urin eliminira iz skriniga M-P Urin će se obrađivati diskontinuirano tj. kod raznih disproteinemija kao i za praćenje bolesti jednom kad je već monoklonski protein identificiran

KROHEM SKUPINA Pododbor za laboratorijsku hematologiju i morfologiju IMUNOKEMIJA: D. Matišić, V. Preden-Kereković Vizualni pregled Bez promjena Bence Jones protein? SERUM Klinička sumnja ili prisutnost monoklonske vrpce Imunofiksacija i/ili imunoelektroforeza Definicija M-P (određ. razreda i tipa) Denzitometrijska kvantifikacija M-P Opisni nalaz + klinička informacija daju tumačenje nalaza Elektroforeza serumskih proteina FREELITE™ : SLLκ, SLLλ + κ/λ Elektroforeza proteina u mokraći (100 x ukonc. uzorak) Negativ. nalaz Prisutan BJ protein Imunofiksacija i/ili imunoelektroforeza Kod bolesnika s multiplim mijelomom, Waldenström makroglobulinemijom i amiloidozom potrebno je pratiti promjene u koncentraciji M-proteina svakih 1-2 mj dok je kod MGNZ dovoljno je: 1 x u godini DIJAGNOSTIČKI ALGORITAM ZA DEFINICIJU MONOKLONSKOG PROTEINA

Gambro-Theralite TM High Cut off technology - M. Storr... ,Queen Elizabeth Hospital, Birmingham, UK (Albumin, IL-6, SLL, Mioglobin, β2m, Inulin, Vitamin B12 (1,3kD-68kD) (hemofiltracija ovisi o: protoku krvi; permeabilnosti membrane; hidrostatskom tlaku na membrani; površini hemofiltera) Pokusi in vitro i matematički modeli su pokazali da je uklanjanje FLC hemodijalizom ovisno o veličini pora dijalizacijske membrane- r>5 nm)

Space is the laboratory of the next millennium Kristali Bence-Jones proteina Razumijevanje strukture kristala BJP moglo bi biti ključno za razvoj selektivne terapije lijekovima. Microgravity Space is the laboratory of the next millennium Mikrogravitacijski uvjeti u svemiru su jedinstveni okoliš za istraživanja koja vode novim produktima i tehnologijama. STS-95 STS-80

International Staging System –ISS (Durie-Salmon) StadijI:medijan 6 g IgG = 47,36 g/l IgA = 0,36 g/l IgM = 0,28 g/l Kvantitativno određeni: BJP κ: 15,20 mg/l (3,30–19,40) BJP λ: 3190,0mg/l (5,71–26,30) Kapa/lambda: 0,00 (0,26 –1,65) International Staging System –ISS (Durie-Salmon) StadijI:medijan 6 g β2-m < 3.5 ; sAlb > 35 g/l Stadij II: medijan 4 g β2-m < 3.5 ali niski alb.< 35 ili β2-m 3.5 - < 5,5 Stadij III:medijan 2g Visoki β2-m > 5.5 ß2m = 9,33 mg/l SE = 120 mm/h Kreatinin = 581 μmol/l Ureja = 54,2mmol/l

Imunofiksacija: A- intaktne molekule Ig i B- slobodnih lakih lanaca -BJP ZLODI ZLODI “M” IgG LAMBDA tipa BJP LAMBDA tipa

A.R. Bradwell – heavy chain/light chain – Hevylite TM - HLC