17 Ιανουαρίου 2018 Όγδοη σειρά ασκήσεων

M – Z – X – W – C W – C – N – A – L A – L – B – R – U 1) Στην E. coli τέσσερα Hfr στελέχη δίνουν τους εξής μάρτυρες κατά σειρά: Στέλεχος 1 M Z X W C Στέλεχος 2 L A N C W Στέλεχος 3 A L B R U Στέλεχος 4 Z M U R B Όλα τα προαναφερόμενα Hfr στελέχη προέρχονται από το ίδιο F+ . Ποια η σειρά των μαρτύρων αυτών στο κυκλικό χρωμόσωμα του γνήσιου F+ στελέχους ; M – Z – X – W – C W – C – N – A – L A – L – B – R – U B – R – U – Μ – Ζ

2). Διασταυρώνουμε 2 στελέχη της E 2) Διασταυρώνουμε 2 στελέχη της E. coli: Hfr arg+ bio+ leu+ x F- arg- bio- leu- . Μελέτες διακοπτόμενης σύζευξης δείχνουν πως η arg+ εισέρχεται τελευταία στον δέκτη επομένως τα ανασυνδυασμένα arg+ επιλέγονται σε μέσο που διαθέτει bio και leu. Τα συγκεκριμένα ελέγχονται για την παρουσία bio+ leu+ δίδοντας τα εξής αποτελέσματα: arg+ bio+ leu+ 320 arg+ bio+ leu- 008 arg+ bio- leu+ 000 arg+ bio- leu- 048 α) Ποια η σειρά των γονιδίων; β) Ποιες οι γενετικές αποστάσεις μεταξύ τους;

arg+ bio+ leu+ 320 arg+ bio+ leu- 008 arg+ bio- leu+ 000 arg+ bio- leu- 048 arg+ bio- leu+ είναι τα πιο σπάνια (δεν παρατηρήθηκε κανένα) οπότε είναι λογικό να υποθέσουμε πως είναι αυτά για την δημιουργία των οποίων απαιτούνται 4 επιχιασμοί. Για να συμβαίνει αυτό πρέπει η σειρά να είναι arg – bio – leu. RF(arg-bio) = 48 / 376 = 0.12766 RF(bio-leu) = 8 / 376 = 0.02127

3) Συγκεκριμένο Hfr στέλεχος μεταδίδει τον μάρτυρα pro+ τελευταίο σε πειράματα σύζευξης. Διασταυρώνοντας το συγκεκριμένο στέλεχος με κάποιο F- κάποια pro+ ανασυνδυασμένα βακτήρια παρατηρούνται στα αρχικά στάδια της σύζευξης. Όταν αυτά τα τελευταία βακτήρια αναμειχθούν με F- κύτταρα τότε η πλειοψηφία των F- βακτηρίων μετατρέπονται σε pro+ που φέρουν τον παράγοντα F. Να εξηγηθούν τα αποτελέσματα. H καλύτερη εξήγηση είναι πως ο παράγοντας F που ήταν ενσωματωμένος στο στέλεχος Hfr αποκολλήθηκε από το βακτηριακό χρωμόσωμα και πλέον έχει μετατραπεί σε παράγοντα F´ που περιέχει το αλληλόμορφο pro+ του αντίστοιχου τόπου. Αυτός ο F´ παράγοντας μεταφέρεται ταχύτατα σε F– κύτταρα μετατρέποντάς τα σε pro+ (και φυσικά σε F+).

4) Ένας φάγος γενικευμένου μετασχηματισμού χρησιμοποιείται για τον μετασχηματισμό ενός στελέχους – δέκτη E. coli a- b- c- d- e- από δότη a+ b+ c+ d+ e+ .Τα βακτήρια που προκύπτουν απλώνονται σε διάφορα θρεπτικά μέσα όπως φαίνεται παρακάτω. Τι μπορείτε να συμπεράνετε για την σύνδεση και σειρά των γονιδίων; Ουσίες που προστέθηκαν Παρουσία (+) ή σε ελάχιστο θρεπτικό μέσο απουσία (-) αποκιών CDE - BDE - BCE + BCD + ADE - ACE - ACD - ABE - ABD + ABC - a+ d+ a+ e+ c+ e+ d – a – e – c

5) Σε πειράματα γενικευμένου μετασχηματισμού φάγοι συλλέγονται από στέλεχος – δότη E. coli γονοτύπου cys+ leu+ thr+ και χρησιμοποιούνται για τον μετασχηματισμό δέκτη με γονότυπο cys- leu- thr- . Αρχικά λοιπόν ο πληθυσμός των δεκτών απλώνεται σε ελάχιστο θρεπτικό μέσο εφοδιασμένο με λευκίνη και θρεονίνη. Παρατηρούμε την ύπαρξη αρκετών αποκιών. Α) Ποιοι οι πιθανοί γονότυποι των αποικιών αυτών; Β) Αντίγραφα αυτών των αποικιών μεταφέρονται σε 3 διαφορετικά θρεπτικά μέσα 1) ελάχιστο + μόνο θρεονίνη 2) ελάχιστο + μόνο λευκίνη 3) ελάχιστο Ποιοι γονότυποι θα μπορούσαν να μεγαλώσουν σε καθένα από αυτά; Γ) Παρατηρήθηκε πως 56% των αρχικών αποικιών μεγαλώνουν στο μέσο 1 του ερωτήματος (Β), 5% στο μέσο 2 ενώ καμιά στο μέσο 3. Με αυτό το δεδομένο ποιοι είναι οι γονότυποι των αποικιών στα μέσα 1, 2 και 3 ; Δ) Σχεδιάστε ένα χάρτη των 3 αυτών τόπων

A. cys+ leu+/- thr+/- B.1. cys+ leu+ thr+/- 2. cys+ leu+/- thr+ 3. cys+ leu+ thr+ Γ. Εφόσον καμιά δεν μεγαλώνει στο μέσο 3 (ελάχιστο) δεν υπάρχει και ο αντίστοιχος γονότυπος. Άρα οι αποικίες που μεγαλώνουν στα μέσα 1 και 2 είναι αντίστοιχα 1. cys+ leu+ thr- και 2. cys+ leu- thr+ 56% 5% Τι είναι τα υπόλοιπα 100 – 56 – 5 = 39 % cys+ leu- thr- Δ. Η cys μετάγεται μαζί με την leu σε ποσοστό 56% ενώ μαζί με την thr μόνο σε ποσοστό 5%. Αυτό σημαίνει πως η cys είναι πιο κοντά στη leu ενώ η thr είναι πιο απομακρυσμένη. Τέλος επειδή δεν παρατηρείται ταυτόχρονη μεταγωγή και των 3 τόπων υποχρεωτικά η cys βρίσκεται ανάμεσα από τις leu και thr.

6) Σε πειράματα λειτουργικής συμπληρωματικότητας τόσο σε προκαρυωτικούς όσο και και ευκαρυωτικούς οργανισμούς η πρωτοτροφία είναι συχνά ο φαινότυπος που επιλέγουμε για να ταυτοποιήσουμε την παρουσία μετασχηματισμένων κυττάρων. Πρωτότροφο κύτταρο χρησιμοποιείται σαν δότης γενετικού υλικού το οποίο εκχυλίζεται και χρησιμοποιείται για τον μετασχηματισμό αυξότροφης καλλιέργειας ληπτών. Μετασχηματισμένα στελέχη αποκαλύπονται όταν τα κύτταρα λήπτες απλώνονται σε ελάχιστο θρεπτικό μέσο και αναζητούνται αποικίες ικανές να μεγαλώνουν σε αυτό. Ποιος πειραματικός σχεδιασμός θα σας επέτρεπε να βεβαιωθείτε πως μια τέτοια αποικία λήπτη που μεγαλώνει σε ελάχιστο θρεπτικό μέσο δεν είναι στην πραγματικότητα α) Ένα πρωτότροφο κύτταρο που «μόλυνε» την αποικία των ληπτών; β) Μια αναστροφή της αυξότροφης μεταλλαγής; α) Για να είμαστε σίγουροι πως δεν πρόκειται να έχουμε μόλυνση από κάποιο πρωτότροφο κύτταρο, η πρωτότροφη σειρά από όπου παίρνουμε τον δότη πρέπει να είναι ευαίσθητη σε κάποιο αντιβιωτικό για το οποίο οι λήπτες εμφανίζονται ανθεκτικοί. Έτσι στο ελάχιστο θρεπτικό μέσο με την βοήθεια του αντίστοιχου αντιβιωτικού θα είναι αδύνατη η ανάπτυξη πρωτότροφων στελεχών. β) Η αυξότροφη μεταλλαγή που θα χρησιμοποιούμε θα φροντίζουμε να μην έχει δυνατότητα αναστροφής πχ να οφείλεται σε κάποια έλλειψη.

8) Υποθέστε πως έχετε στην διάθεσή σας ένα στέλεχος δροσόφιλας από το οποίο μπορείτε να πάρετε αρσενικά ή (παρθένα) θηλυκά οποιαδήποτε στιγμή. Το στέλεχος είναι ομόζυγο για το δεύτερο χρωμόσωμα το οποίο φέρει μια περικεντρική αναστροφή που λειτουργεί ως καταστολέας του επιχιασμού. Μέσα στην αναστροφή υπάρχουν ο γενετικός τόπος Curly(Cy,+) ο οποίος ευθύνεται για άτομα με φτερά ανεστραμμένα προς τα πάνω και ο τόπος purple(pr,+) που δίνει μύγες με σκούρο χρώμα ματιών. (Οι δυο τόποι βρίσκονται εκατέρωθεν του κεντρομεριδίου). Το στέλεχός μας έχει τόσο ανεστραμμένα προς τα πάνω φτερά όσο και σκούρο χρώμα ματιών. Θέλετε να απομονώσετε θνησιγόνες μεταλλαγές που να αφορούν γενετικούς τόπους του δεύτερου χρωμοσώματος και για τον σκοπό αυτό ακτινοβολείτε αρσενικά αγρίου τύπου. Πώς θα προχωρούσατε στην συνέχεια;

Διασταυρώνω κάθε ένα ακτινοβολημένο αρσενικό ΧΩΡΙΣΤΑ με μερικά θηλυκά του στελέχους. Cy pr / Cy pr X + + *1 / + + *2 Κάθε αρσενικό έχει υποστεί διαφορετικές μεταλλαγές από την ακτινοβολία. Έτσι μπορώ να αποκτήσω σειρές που φέρουν συγκεκριμένες μεταλλαγές η καθεμία εκμεταλλευόμενος και το γεγονός πως τα υβρίδια θα είναι ετερόζυγα για την αναστροφή άρα δεν θα δίνουν ανασυνδυασμένους απογόνους. 2) Διασταυρώνω τα ετερόζυγα θηλυκά που προκύπτουν με αρσενικά [Cy pr]. Cy pr / + + *1 X Cy pr / Cy pr 3) Από την διασταύρωση επιλέγω [Cy] αρσενικά και θηλυκά που σημαίνει πως είναι ετερόζυγα για την μεταλλαγή και τα διασταυρώνω μεταξύ τους. Αν παίρνω αγρίου τύπου απογόνους σημαίνει πως η μεταλλαγή δεν είναι θνησιγόνος διαφορετικά είναι. Cy pr / + + *1 X Cy pr / + + *1 Cy pr / Cy pr [Cy pr] ¼ Cy pr / + + *1 [Cy] ½ + + *1 / + + *1 [+ +] ¼ (αν επιζούν)

H rW μπορεί να είναι μια διπλή μεταλλαγή στους τόπους Α και Β. H rW μπορεί να είναι μια έλλειψη που καλύπτει μέρος ή ολόκληρα τα rZ και rD. Μεταλλαγές που χαρτογραφούνται ανάμεσα στα rZ και rD θα δίνουν ανασυνδυαμένους απογόνους αγρίου τύπου όντας ετερόζυγες με την rW αν ισχύει το πρώτο. Κάτι τέτοιο όμως είναι αδύνατο αν ισχύει το δεύτερο.

10) α) Με δεδομένο πως σε ένα γενετικό τόπο μπορούν να συμβούν πολλές μεταλλαγές, πως θα μπορούσατε να ταυτοποιήσετε αυτές που οφείλονται σε ελλείψεις; β) Ένας γενετικός χάρτης με ελλείψεις του γενετικού τόπου nadB φαίνεται στο σχήμα. Οι μαύρες έντονες γραμμές αναπαραστούν την περιοχή που λείπει σε κάθε έλλειψη.

Για να εντοπιστεί η ακριβής θέση αρκετών μεταλλαγών του συγκεκριμένου τόπου, οι τελευταίες χαρτογραφούνται σε σχέση με τις ελλείψεις με τα αποτελέσματα που φαίνονται στον πίνακα ( + σημαίνει ύπαρξη ανασυνδυασμένων απογόνων αγρίου τύπου, ενώ με – σημειώνεται η απουσία τους). Με βάση αυτά τα δεδομένα να φτιάξετε τον χάρτη της περιοχής. nad+ nad-171 nad-172 nad-173 nad-174 nad-118 Δnad-103 + - Δnad-105 Δnad-107 Δnad-108 Δnad-109 Δnad-110 Δnad-111 Δnad-112 Δnad-126

Οι μεταλλαγές που οφείλονται σε ελλείψεις συνήθως δεν αναστρέφονται. Αδυναμία να υπάρξουν απόγονοι αγρίου τύπου από ανασυνδυασμό με άλλες μεταλλαγές οι οποίες μεταξύ τους μπορούν να δώσουν ανασυνδυασμένους απογόνους αγρίου τύπου είναι ακόμα ισχυρότερη ένδειξη μιας μεταλλαγής που οφείλεται σε κάποια έλλειψη. 171 173 174 172