7/11/2018.

Παρουσίαση με θέμα: "7/11/2018."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 7/11/2018

2 Επικ. Καθηγήτρια Β. Μαγκαφά
Πρόγραμμα Καραθεοδωρή_2010 Πανεπιστήμιο Πατρών ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΩΝ ΒΙΟΛΟΓΙΚΩΝ & ΑΝΤΙΚΑΡΚΙΝΙΚΩΝ ΙΔΙΟΤΗΤΩΝ ΤΗΣ ΟΡΜΟΝΗΣ ΤΗΣ ΝΕΥΡΟΫΠΟΦΥΣΕΩΣ ΩΚΥΤΟΚΙΝΗΣ ΜΕΣΩ ΤΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ & ΜΕΛΕΤΗΣ ΔΟΜΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΑΥΤΗΣ Επικ. Καθηγήτρια Β. Μαγκαφά Τμήμα Φαρμακευτικής 7/11/2018

3 Η ΩΚΥΤΟΚΙΝΗ Η ωκυτοκίνη (ΟΤ) [κυκλο(H-Cys1-Tyr2-Ile3-Gln4-Asn5-Cys6)-Pro7-Leu8-Gly9-NH2] είναι μια ορμόνη της νευροϋποφύσεως με ευρύ φάσμα βιολογικών ιδιοτήτων, όπως δράση επί της εκθλίψεως του γάλακτος, ωκυτόκειο δράση, χαλάρωση αγγειακών και καρδιακών μυών, ρύθμιση ισορροπίας αλάτων/νερού. Ο υποδοχέας της ωκυτοκίνης (OTR) έχει ανιχνευθεί σε μεγάλο αριθμό ιστών, όπως το μυομήτριο, το ενδομήτριο, τα νεφρά, την καρδιά, το πάγκρεας, τα κύτταρα της επιδιδυμίδας & των όρχεων των ανδρών, τον εγκέφαλο κ.ά. Είναι επίσης γνωστό ότι η ΟΤ παίζει ρόλο στη σεξουαλική, μητρική και κοινωνική συμπεριφορά, ενώ εμπλέκεται και στη διαδικασία μάθησης και μνήμης. (a) Gimpl, G., Fahrenholz, F, Physiol. Rev., 81 (2001) 629. (b) Savaskan, E., Ehrhardt, R., Schulz, A., Walter, M., Schachinger, H., Psychoneuroendocrinology, 33 (2008) 368 7/11/2018

4 Μεγάλος αριθμός αναλόγων της ωκυτοκίνης έχει αποτελέσει το αντικείμενο εκτεταμένων φαρμακολογικών ερευνών, λόγω του ιδιαίτερου ρόλου τον οποίο διαδραματίζει η ΟΤ στη διαδικασία του τοκετού. Ο πρόωρος τοκετός είναι ο κύριος παράγοντας θνησιμότητας και νοσηρότητας στη νεογνική ηλικία. Περίπου 5-10% των τοκετών είναι πρόωροι Επειδή οι ανταγωνιστές της ωκυτοκίνης, σε σχέση με τα χρησιμοποιούμενα τοκολυτικά φάρμακα (όπως β-αδρενεργικοί αγωνιστές, αναστολείς της συνθετάσης της προσταγλαδίνης, αναστολείς των διαύλων ασβεστίου) παρουσιάζουν μεγαλύτερη ιδιαιτερότητα και βελτιωμένες ιδιότητες, ανάλογα της ΟΤ με ισχυρή αντιωκυτόκειο δράση έχουν συντεθεί με σκοπό να χρησιμοποιηθούν για την αντιμετώπιση του πρόωρου τοκετού . Lamont, R.F , Br. J. Obstet. Gynaecol., 110 (2003) 108. 7/11/2018

5 c[Mpa1-D-Tyr(Et)2-Ile3- Thr4-Asn5-Cys6]-Pro7-Orn8-Gly9-CONH2
Σήμερα, παρά το γεγονός ότι έχει ανακοινωθεί μεγάλος αριθμός αναλόγων της ωκυτοκίνης, πολύ λίγα έχουν δοκιμαστεί σε μοντέλα εγκύων ζώων είτε γιατί είχαν χαμηλή συγγένεια, είτε γιατί είχαν χαμηλή εκλεκτικότητα για τον υποδοχέα και μόνο ένα, το Αtosiban ([Mpa1, D-Tyr(Et)2, Thr4, Orn8]OT), έχει εγκριθεί (με το όνομα Tractocile από την εταιρεία Ferring) για κλινική χρήση στην Ευρώπη c[Mpa1-D-Tyr(Et)2-Ile3- Thr4-Asn5-Cys6]-Pro7-Orn8-Gly9-CONH2 Atosiban Τα τελευταία χρόνια άλλος ένας πεπτιδικός ανταγωνιστής της ωκυτοκίνης, το Barusiban, με υψηλή συγγένεια πρόσδεσης στον OTR ελέγχεται για τη δυνατότητα χρήσης του στον πρόωρο τοκετό. (a) Melin, P, Trojnar, J., Johansson, B., Vilhardt, H., and Åkerlund, M., J. Endocrinol., 111 (1986)125. (b) Romero R, Sibai BM, Sanchez-Ramos L, Valenzuela GJ, VeilleJ-C, and Tabor B, Am. J. Obstet. Gynecol. 182 (2000) 1173. (c) Borthwick, A. D., Ann. Rep. Med. Chem., 41 (2006) 409.

6 Επιπλέον, εξαιτίας του μεγάλου εύρους των δράσεων της ωκυτοκίνης, οι ανταγωνιστές αυτής θα μπορούσαν εκτός από πολλά υποσχόμενοι αναστολείς του πρόωρου τοκετού να φανούν χρήσιμοι και στη θεραπεία ασθενειών όπως είναι το άγχος, σεξουαλικές δυσλειτουργίες, διαταραχές της ορέξεως κ.α. Επιπροσθέτως τα τελευταία χρόνια γίνεται μια σύνδεση του συστήματος ΟΤ-OTR με το ευρύ φάσμα των ασθενειών που σχετίζονται με τον αυτισμό. Τα τελευταία χρόνια, ένας νέος ρόλος της Ωκυτοκίνης στην παθολογία του καρκίνου έχει αναδειχτεί. Οι υποδοχείς της ωκυτοκίνης έχουν βρεθεί σε πολλούς ανθρώπινους καρκινικούς ιστούς και κυτταρικές σειρές (ορμονοεξαρτώμενες και μη), όπως είναι: ο ανθρώπινος καρκίνος του μαστού, το λειομύωμα, το αδενοκαρκίνωμα του ενδομητρίου, το νευροβλάστωμα και το γλοίωμα. Cassoni, P., Fulcheri, E., Carcangiu, M.L., Stella, A., Deaglio, S., and Bussolati, G., J. Pathol., 190 (2000) 470. 7/11/2018

7 Ανταγωνιστές της Ωκυτοκίνης
Σχεδιασμός Ανταγωνιστών Εισαγωγή μη φυσικών αμινοξέων στην πεπτιδική αλληλουχία Περιορισμός διαμορφωτικής ελευθερίας του C-τελικού τριπεπτιδίου Ανταγωνιστές της Ωκυτοκίνης Εισαγωγή D- αρωματικού αμινοξέος στη θέση 2 Απαλοιφή N- τελικής αμινομάδας (a) Assimomytis, N., Magafa, B., Theodoropoulos, D., Cordopatis, P. and Slaninova, J., Letters in Peptide Science, 3 (1996) 217; (b) Walter, R., Stahl, G.L., Caplaneris, T., Cordopatis, P. and Theodoropoulos, D., Journal of Medicinal Chemistry, 22 (1979) 890; (c)Hill, P.S., Smith, D.D., Slaninová, J., and Hruby, VJ., J. Am. Chem. Soc., 112 (1990) 3110.

8 Α. Σχεδιασμός & Σύνθεση νέων αναλόγων της Ωκυτοκίνης (OT)
Στηριζόμενοι στα προαναφερθέντα βιβλιογραφικά δεδομένα σχεδιάσαμε και συνθέσαμε 25 νέα ανάλογα της ΟΤ με δομικές αλλαγές στην πεπτιδική αλληλουχία για την παραλαβή ανταγωνιστών με ισχυρή αντι-ωκυτόκειο δράση, εκλεκτικότητα και υψηλή δέσμευση με τον ωκυτόκειο υποδοχέα 7/11/2018

9 Επικ. Καθηγήτρια Β. Μαγκαφά, Τμήμα Φαρμακευτικής
7/11/2018 Επικ. Καθηγήτρια Β. Μαγκαφά, Τμήμα Φαρμακευτικής

10 Πεπτιδική σύνθεση σε στερεή φάση Χρήση Fmoc/But μεθοδολογίας
Fields, B. G., Noble, L. R. (1990) Int. J. Pept. Prot Res. 35:

11 Βελτιστοποίηση πρωτοκόλλων σύνθεσης και καθαρισμού
Επιλογή ρητίνης Απόσπαση των πεπτιδίων από τη ρητίνη, καθώς και η απομάκρυνση των πλάγιων προστατευτικών ομάδων [TFA/DCM (80:20 v/v) παρουσία δεσμευτών κατιόντων] Σχηματισμό του δισουλφιδικού δεσμού έγινε με την επίδραση διαλύματος: DMSO / H2O (20 : 80 v/v) Ο αρχικός καθαρισμός των πεπτιδίων γίνεται με χρωματογραφία διηθήσεως πηκτής σε Sephadex G-15 ® (Εκλούτης 25% Οξικό οξύ) (gel filtration chromatography) Ο πλήρης καθαρισμός με RP-HPLC (Χρωματογραφική στήλη ανάστροφης φάσης C-18) Η ταυτοποίηση πραγματοποιήθηκε με ES-MS

12 TLC RP-HPLC 1-butanol: acetic acid: water (4:1:5, v/v, upper phase),
1-butanol: acetic acid: water: pyridine (4:1:1:2, v/v) RP-HPLC 5 to 85% acetonitrile (0.1% TFA) for 30 min 7/11/2018

13 Ενδεικτικά HPLC & MS φάσματα των αναλόγων
Πεπτιδική Σύνθεση

14

15 Β. Βιολογικός έλεγχος των συντεθέντων αναλόγων
Ο πρωταρχικός βιολογικός έλεγχος των νέων αναλόγων της Ωκυτοκίνης πραγματοποιήθηκε σε συνεργαζόμενο με το Εργαστήριο μας ερευνητικό κέντρο της αλλοδαπής και συγκεκριμένα από τη Dr Jirina Slaninova (Department of Antimicrobial Peptides, Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, Academy of Sciences of Czech Republic, Flemingovo square 2, Prague 6, CZ-16610, Czech Republic) και περιλαμβάνει δοκιμές οι οποίες αφορούν: α) προσδιορισμό της ωκυτοκείου δράσεως in vitro πάνω σε απομονωμένη ταινία μήτρας επίμυος απουσία μαγνησίου, β) δράση επί της πιέσεως σε άρρενες επίμυες οι οποίοι έχουν επεξεργαστεί με φαινοξυβενζαμίνη, και γ) προσδιορισμό της συγγένειας με τον ανθρώπινο υποδοχέα με τη χρήση τριτιωμένης Ωκυτοκίνης σε τμήμα ακατέργαστης κυτταρικής μεμβράνης από τα ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα [Human embryonic kidney (HEK)] τα οποία εκφράζουν σταθερά τον ανθρώπινο Ωκυτόκειο υποδοχέα. 7/11/2018

16 Επικ. Καθηγήτρια Β. Μαγκαφά, Τμήμα Φαρμακευτικής
7/11/2018 Επικ. Καθηγήτρια Β. Μαγκαφά, Τμήμα Φαρμακευτικής

17 7/11/2018

18 7/11/2018

19 7/11/2018

20 Από τα αποτελέσματα των βιολογικών δοκιμών των αναλόγων διαπιστώνεται ότι:
Η αντικατάσταση της Ile3 από μη φυσικά αμινοξέα σε συνδυασμό με την εισαγωγή D-Tyr(Et) ή D-1-Nal στη θέση 2 και Mpa στη θέση 1 επηρεάζει σημαντικά την ωκυτόκιο δράση Η υποκατάσταση της Tyr2 με D-1-Nal οδηγεί σε ανάλογα βελτιωμένης δράσης και συγγένειας σε σχέση με αυτά που περιέχουν D-Tyr(Et). Τα ανάλογα που φέρουν υποκατάσταση με L-εναντιομερή παράγωγα στη θέση 3 εμφανίζουν μεγαλύτερη δράση από τα αντίστοιχα με D-εναντιομερή (σημασία στερεοχημικής διάταξης αμινοξέος της θέσεως 3) 7/11/2018

21 Γ. ΑΝΑΛΥΣΗ ΔΙΑΜΟΡΦΩΣΕΩΣ
Νέα συνθετικά ανάλογα της ΟΤ, μελετήθηκαν διαμορφωτικά με χρήση φασματοσκοπίας NMR και υπολογιστικής χημείας. Η μελέτη της διαμορφωτικής ανάλυσης αρχικά περιλαμβάνει την ταυτοποίηση των ενώσεων με λήψη και επεξεργασία φασμάτων NMR μίας (1Η και 13C) και δύο διαστάσεων (COSY, TOCSY, NOESΥ). Παράλληλα, με τη βοήθεια προγραμμάτων Μοριακής Μοντελοποίησης, υπολογίζονται διαμορφώσεις χαμηλής ενέργειας των συνθετικών ενώσεων, με τεχνικές Διαμορφωτικής Ανάλυσης και Μοριακής Προσομοίωσης Στόχος είναι η συσχέτιση δομής-δράσης των ενώσεων και η αποσαφήνιση των δομικών χαρακτηριστικών (φαρμακοφόρων ομάδων) που είναι υπεύθυνες για την τη δραστικότητά τους. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε στο Ινστιτούτο Οργανικής και Φαρμακευτικής Χημείας στο Εθνικό Κέντρο Ερευνών από τον Δρ. Π. Ζουμπουλάκη και την μεταπτυχιακή φοιτήτρια Ε. Κρίτση. 7/11/2018

22 Cys1 Tyr2 Gly9 Leu8 Ile3 Cys6 Asn5 Gln4 Pro7
Η ελαχιστοποιημένη ενεργειακά αντιπροσωπευτική διαμόρφωση του πεπτιδίου ΟΤ, στην οποία απεικονίζονται οι ενδομοριακοί δεσμοί υδρογόνου καθώς και ο προσανατολισμός των πλευρικών ομάδων. 7/11/2018

23 Asn5 Cys6 Pro7 Gln4 Mpa1 L-Thi3 D-1-Nal2 Leu8 Gly9
Η ελαχιστοποιημένη ενεργειακά αντιπροσωπευτική διαμόρφωση του πεπτιδίου [Mpa1, D-1-Nal2, L-Thi3] OT [pA2=8.50±0.24 ], στην οποία απεικονίζονται οι ενδομοριακοί δεσμού υδρογόνου καθώς και ο προσανατολισμός των πλευρικών ομάδων. 7/11/2018

24 D-Tyr(Et)2 L-Thi3 Mpa1 Pro7 Cys6 Gln4 Leu8 Asn5 Gly9
Η ελαχιστοποιημένη ενεργειακά αντιπροσωπευτική διαμόρφωση του πεπτιδίου [Mpa1, D-Tyr(Et)2, L-Thi3] OT [pA2 =7.09±0.13], στην οποία απεικονίζεται ο ενδομοριακός δεσμός υδρογόνου καθώς και ο προσανατολισμός των πλευρικών ομάδων. 7/11/2018

25 Gln4 Asn5 Cys6 Gly9 Mpa1 D-Thi3 Pro7 Leu8 D-Tyr(Et)2
Η ελαχιστοποιημένη ενεργειακά αντιπροσωπευτική διαμόρφωση του πεπτιδίου: [Mpa1, D-Tyr(Et)2, D-Thi3] OT [pA2=0], στην οποία απεικονίζεται ο προσανατολισμός των πλευρικών ομάδων. 7/11/2018

26 [Mpa1, D-Tyr(Et)2, D-Thi3] OT (πορτοκαλί χρώμα).
L-Thi3 D-Thi3 Υπέρθεση των αντιπροσωπευτικών διαμορφώσεων των πεπτιδίων [Mpa1, D-Tyr(Et)2, L-Thi3] OT (μπλέ χρώμα) και [Mpa1, D-Tyr(Et)2, D-Thi3] OT (πορτοκαλί χρώμα). 7/11/2018

27 H αντικατάσταση των αμινοξέων στις θέσεις 1, 2, 3 επηρεάζει τη β-στροφή που δημιουργείται ανάμεσα στα αμινοξέα Tyr2-Ile3-Gln4-Asn5 της ΟΤ, η οποία είναι απαραίτητη για την εμφάνιση δράσης Η απουσία β-στροφής καθώς και ο κοινός προσανατολισμός των πλευρικών ομάδων των αμινοξέων στις θέσεις 2 και 3 οδηγεί σε μειωμένη δράση ή και στην παντελή έλλειψη δράσης 7/11/2018

28 Δ. ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΣΤΟΝ ΠΟΛΛΑΠΛΑΣΙΑΣΜΟ ΚΑΡΚΙΝΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΤΩΝ ΝΕΩΝ ΑΝΑΛΟΓΩΝ ΤΗΣ ΩΚΥΤΟΚΙΝΗΣ
Μέρος των αναλόγων ελέχθηκαν για τη δράσης τους στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, σε συνεργασία με το Εργαστήριο Κλινικής Ογκολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών (Καθηγητής Χ. Καλόφωνος και με τη βοήθεια της Δρ. Ε. Γιαννοπούλου). Στα πειράματα αυτά συμμετείχε ένας προπτυχιακός φοιτητής από το Εργαστήριο Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών Προϊόντων. 7/11/2018

29 7/11/2018

30 7/11/2018

31 Τα αποτελέσματα από τη μελέτη αυτή έδειξαν ότι η επίδραση των αναλόγων στον πολλαπλασιασμό καρκινικών κυττάρων μαστού εξαρτάται από τις τροποποιήσεις του μορίου της Ωκυτοκίνης. Υψηλή αντιωκυτόκειο δράση δεν ταυτίζεται με την ανασταλτική δράση επί του πολλαπλασιασμού καρκινικών κυττάρων μαστού ανάλογα με χαμηλή ή και καθόλου αντιωκυτόκειο δράση πολλές φορές παρουσιάζουν δράση επί του πολλαπλασιασμού καρκινικών κυττάρων μαστού Απαιτείται περαιτέρω διερεύνηση της σχέσης μεταξύ δομικών αλλαγών στο μόριο της ωκυτοκίνης & ανασταλτικής δράσεως επί του πολλαπλασιασμού καρκινικών κυττάρων μαστού 7/11/2018

32 Συνοψίζοντας Πραγματοποιήθηκε η σύνθεση 25 νέων αναλόγων της ωκυτοκίνης, σε καλή απόδοση και καθαρότητα Πέντε (5) ανάλογα παρουσιάζουν ιδιαίτερα ισχυρή αντι-ωκυτόκειο δράση & εκλεκτικότητα σύνδεσης με τον ωκυτόκειο υποδοχέα (συγκρίσιμες με αυτήν του tractocile) παράγοντες ικανοί να τα χαρακτηρίσουν ως χρήσιμους τοκολυτικούς παράγοντες Επιπροσθέτως έγινε συσχέτιση δομής-δράσης με πειράματα φασματοσκοπίας NMR και υπολογιστικής χημείας και εξήχθησαν χρήσιμα συμπεράσματα Απαιτείται περαιτέρω διερεύνηση για το τι δομικές αλλαγές πρέπει να γίνουν στο μόριο της ωκυτοκίνης για την εμφάνιση ανασταλτικής δράσεως επί του πολλαπλασιασμού καρκινικών κυττάρων μαστού 7/11/2018

33 Mεταπτυχιακοί φοιτητές που συμμετείχαν στο έργο
και αμείβονταν από το Πρόγραμμα Α/Α Ονοματεπώνυμο ΜΦ Επίπεδο Σπουδών (MSc ή PhD) 1 Ρεβέκκα Εξαρχάκου PhD (18 μήνες) 2 Ευτυχία Κρίτση 7/11/2018

34 (Υπό συγγραφή) (Υπό συγγραφή) 7/11/2018

35 7/11/2018

36 7/11/2018

37 4. “Conformational features discrimination of oxytocin analogues by nuclear magnetic resonance spectroscopy and molecular dynamics simulations” Eftichia Kritsi, Constantinos Potamitis, Panagiotis Zoumpoulakis, Nikolaos L. Assimomytis, Lenka Borovičková, Jiřina Slaninová, Paul Cordopatis, Vassiliki Magafa* , 160 Συνέδριο φαρμακοχημείας, Πάτρα 2015 7/11/2018