ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΑ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΜΑΤΑ ΧΡΩΣΕΙΣ ΒΑΣΙΛΙΚΗ Γ. ΚΟΥΜΑΚΗ-ΚΩΣΤΑΚΗ MD MPH PhD Λεκτορας Μικροβιολογιας ΕΚΠΑ

Σημερινή άσκηση Θα περιγράψουμε τους διαφορετικούς τύπους μικροσκοπίων Θα αναλύσουμε τη χρησιμότητα τους για άμεσα νωπά παρασκευάσματα (χωρίς χρώση) Θα περιγράψουμε τη χρησιμότητα των απλών, διαφορικών χρώσεων αλλά και των ειδικών χρώσεων ,για μικρόβια τα οποία πρέπει να υποστούν ειδικές χρώσεις για να παρατηρήσουμε χαρακτηριστικές δομές τους όπως κυτταρικό τοίχωμα, κάψες και άλλα Πρακτική άσκηση μικροσκόπησης σε παρασκεύασμα μεσοδοντίου με απλή χρώση μπλε του μεθυλενίου και χρώση Gram

ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΗΣΗ ΑΜΕΣΗ ΑΝΑΖΗΤΗΣΗ ΤΩΝ ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ Οι μικροοργανισμοί είναι πάρα πολύ μικροί και δεν είναι ορατοί με γυμνό μάτι Για την παρατήρηση τους χρησιμοποιούνται μικροσκόπια που μεγεθύνουν το αντικείμενο παρατήρησης. Στόχος όλων των μεθόδων είναι να καταστήσουν το αόρατο (μικρόβια) ορατό Έτσι είναι δυνατή η μελέτη της μορφολογικής δομής των μικροβίων, η ταυτοποίηση τους, ο προσδιορισμός των λοιμογόνων ιδιοτήτων και να γίνει εφικτή η φαρμακευτική τους αντιμετώπιση

ΕΙΔΗ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΩΝ Φωτονικά μικροσκόπια (χρησιμοποιούν το ορατό φως ως φωτεινή πηγή για την παρατήρηση δειγμάτων) 1.Κοινό ή σύνθετο μικροσκόπιο 2. Μικροσκόπιο σκοτεινού πεδίου 3. Μικροσκόπιο αντίθεσης φάσεων 4. Μικροσκόπιο φθορισμού Ηλεκτρονικά μικροσκόπια (χρησιμοποιείται μια ακτίνα ηλεκτρονίων αντί του φωτός)

ΚΟΙΝΟ Η ΣΥΝΘΕΤΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ Πρόκειται για το μικροσκόπιο που χρησιμοποιείται στην καθημερινή εργαστηριακή πράξη γιατί είναι εύχρηστο Είναι εφοδιασμένο με 3 είδη φακών τους προσοφθάλμιους, τους αντικειμενικούς, και τον συγκεντρωτικό

1. ΚΟΙΝΟ Η ΣΥΝΘΕΤΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ Οι αντικειμενικοί φακοί είναι αυτοί που στοχεύουν την τράπεζα του μικροσκοπίου, δηλαδή βρίσκονται κοντά στο παρασκευάσμα. Εναλλάσσονται και κάθε φορά χρησιμοποιείται ένας. Είναι 4 ο σαρωτικός (10x), ο μικρής μεγέθυνσης (20x), ο μεγάλης μεγέθυνσης 40x και ο ελαιοκαταδυτικός (100x) Οι προσφθάλμιοι φακοί είναι δύο (δυοφθάλμιο μικροσκόπιο). Συνήθως χρησιμοποιούνται φακοί 10x O συγκεντρωτικός φακός εστιάζει το φως της φωτεινής πηγής στο παρασκεύασμα

ΚΟΙΝΟ Η ΣΥΝΘΕΤΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ Η συνολική μεγέθυνση παρατήρησης είναι το γινόμενο της μεγέθυνσης του χρησιμοποιούμενου αντικειμενικού φακού επί (x) τη μεγέθυνση των προσοφθάλμιων φακών (π.χ. σε παρατήρηση με ελαιοκαταδυτικό φακό , η τελική μεγέθυνση παρατήρησης είναι 100x x 10x =1000x Η διακριτική ικανότητα (ανάλυση) είναι το μέτρο της ικανότητας σαφούς διαχωρισμού δύο γειτονικών αντικειμένων. Αδρά, το ανώτατο όριο του κοινού μικροσκοπίου ισούται με 200nm (0.2μm). Τα περισσότερα βακτηριακά κύτταρα έχουν διάμετρο από 0.3-1μm.Έτσι, τα εσωτερικά τους οργανίδια δεν είναι ορατά.

Σύνθετο μικροσκόπιο-κεχρωσμένα δείγματα Για να λάβουμε μια σαφή εικόνα από το σύνθετο φωτονικό μικροσκόπιο, τα παρατηρούμενα πρέπει να εμφανίζουν αντίθεση με το μέσον τους (την ουσία στην οποία είναι τοποθετημένα). Για να επιτύχουμε αυτή την αντίθεση πρέπει να μεταβάλλουμε τον δείκτη διάθλασης του μέσου Δείκτης διάθλασης είναι το μέτρο της δυνατότητας κάμψης των ακτινών του φωτός ενός υλικού Ένας τρόπος μεταβολής του δείκτη διάθλασης είναι ο χρωματισμός των δειγμάτων με ειδικές χρωστικές Έτσι οι ακτίνες που περνούν από το κεχρωσμένο δείγμα θα ακολουθούν διαφορετική πορεία από αυτές που περνούν από το μέσο Η ελαφρώς διαφορετική πορεία των ακτίνων συλλέγεται και μεγεθύνεται από τους αντικειμενικούς φακούς

ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ ΣΚΟΤΕΙΝΟΥ ΠΕΔΙΟΥ Χρησιμοποιείται για την εξέταση των ζωντανών μικροοργανισμών, που είτε είναι αόρατοι στο συνηθισμένο φωτονικό μικροσκόπιο, είτε δεν μπορούν να χρωματιστούν με τις συνήθεις μεθόδους ή καταστρέφονται από τις χρωστικές Συνήθως χρησιμοποιείται για τις πολύ λεπτές σπειροχαίτες, όπως Treponema pallidum, που προκαλεί την σύφιλη.

ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ ΣΚΟΤΕΙΝΟΥ ΠΕΔΙΟΥ Αντί του κανονικού συγκεντρωτικού φακού, χρησιμοποιεί έναν φακό που περιέχει έναν αδιαφανή δίσκο. Ο δίσκος εμποδίζει το φως που θα έμπαινε στον αντικειμενικό φακό άμεσα Μόνο το φως που διαθλάται από το δείγμα περνάει από τον αντικειμενικό φακό. Επειδή δεν υπάρχει κανένα άμεσο φως από το υπόβαθρο, το δείγμα εμφανίζεται φωτεινό σε σκούρο υπόβαθρο- το σκοτεινό πεδίο.

Μικροσκόπιο αντίθεσης φάσεων Χρησιμοποιείται για την παρατήρηση ζωντανών παρασκευασμάτων και επιτρέπει τη λεπτομερή εξέταση των εσωτερικών δομών των μικροοργανισμών Εκμεταλλεύεται το γεγονός ότι οι φωτεινές ακτίνες μπορεί να βρίσκονται στην ίδια ή διαφορετική φάση κύματος. Εάν η κορυφή του κύματος του φωτός από μία πηγή συμπίπτει με την κορυφή του κύματος του φωτός από μία άλλη πηγή, οι ακτίνες αλληλεπιδρούν και ενισχύονται (ίδια φάση- σχετική φωτεινότητα). Εάν η κορυφή του κύματος του φωτός συμπίπτει με την κοιλάδα του κύματος του φωτός από μία άλλη πηγή, οι ακτίνες αλληλοαναιρούνται (διαφορετική φάση-σχετικό σκοτάδι)

Μικροσκόπιο αντίθεσης φάσεων Ορισμένες ακτίνες μόνο διαπερνούν το δείγμα (υπάρχει δακτυλιοειδές διάφραγμα) χωρίς να αλλάξουν πορεία, ενώ άλλες διαθλώνται ή περιθλώνται από ορισμένα στοιχεία του δείγματος Περίθλαση αφορά την μεταβολή της πορείας του φωτός κοντά στα άκρα συγκεκριμένων δομών που υπάρχουν στο δείγμα. Τελικά τα σύνολα των ακτινών που δεν αλλάζουν πορεία και διαθλώμενων ακτινών συγκεντρώνονται και σχηματίζουν μια εικόνα του δείγματος, που περιέχει σχετικά φωτεινές και γκρίζες περιοχές Διευκολύνει τη λεπτομερή εξέταση εσωτερικών δομών ζωντανών δειγμάτων

Μικροσκόπιο σκοτεινού πεδίου https://microbiologyspring2010.wikispaces.com/Syphilis

ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ Τα παρασκευάσματα χρωματίζονται με τεχνητές φθοριζούσες ουσίες (φθοριοχρώματα) Τα φθοριοχρώματα απορροφούν το φως μικρού μήκους κύματος (υπεριώδες φάσμα) και εκπέμπουν φως σε μεγαλύτερο μήκος κύματος (ορατό φάσμα) Τεχνική των αντισωμάτων φθορισμού ή ανοσοφθορισμού (FA)

ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ Για την παρατήρηση των αντικειμένων χρησιμοποιείται δέσμη ηλεκτρονίων αντί φωτός Το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο διέλευσης χρησιμεύει για την παρατήρηση ενδοκυττάριων δομών (ακόμη και μορίων νουκλεικών οξέων), ενώ το σαρωτικό ηλεκτρονικό μικροσκόπιο χρησιμεύει για τη μελέτη δομών που βρίσκονται στις επιφάνειες των κυττάρων

Άλλα μικροσκόπια….

Μικροσκόπιο αντίθεσης διαφορικής συμβολής (DIC) Όπως το μικροσκόπιο αντίθεσης φάσεων, εκμεταλλεύεται διαφορές του δείκτη διάθλασης των ουσιών που βρίσκονται στα παρατηρούμενα δείγματα 2 ακτίνες φωτός αντί για 1 Πρισματικοί φακοί προκειμένου να διαχωρίσει κάθε φωτεινή ακτίνα, δημιουργώντας την ψευδαίσθηση ύπαρξης χρωμάτων

Μικροσκόπιο αντίθεσης διαφορικής συμβολής (DIC)

Συνεστιακό μικροσκόπιο Τα δείγματα είναι σημασμένα με φθοριοχρώματα Μια ακτίνα laser διαπερνά κάθε φορά μια επιφάνεια του δείγματος (το οποίο επιστρέφει εκπεμπόμενο ορατό φως που λαμβάνεται από ένα μικρό ειδικό διάφραγμα του μικροσκοπίου Το δείγμα σαρώνεται σταδιακά έως ότου ληφθούν εικόνες από όλες τις επιφάνειες (τομές) Παρέχει δισδιάστατες και τρισδιάστατες εικόνες, κυρίως για ερευνητική χρήση

Συνεστιακό μικροσκόπιο

Ηχητικό μικροσκόπιο σάρωσης Χρησιμοποιεί ηχητικά κύματα συγκεκριμένης συχνότητας που προσκρούουν στο δείγμα Τα διάφορα συστατικά του δείγματος ανακλούν με διαφορετικό τρόπο αυτό το κύμα Συλλέγονται εκείνα που αντανακλώνται από το δείγμα για να σχηματιστεί μέσω υπολογιστικών τεχνικών η εικόνα του αντικειμένου Χρησιμοποιείται για τη μελέτη ζωντανών κυττάρων που είναι προσκολλημένα σε επιφάνειες, όπως καρκινικά κύτταρα, αθηρωματικές πλάκες και βιομεμβράνες

Ηχητικό μικροσκόπιο σάρωσης

Μικροσκόπια σάρωσης-ανίχνευσης Μικροσκόπιο σάρωσης οπών Μικροσκόπιο ατομικής ενέργειας Χρησιμοποιούν διάφορα είδη ανιχνευτών (π.χ.ανιχνευτή μετάλλου- διαμαντιού) για να εξετάσουν την επιφάνεια ενός δείγματος από πολύ μικρή απόσταση Δίνουν πολύ λεπτομερείς εικόνες μορίων μέσα στα κύτταρα

Μικροσκόπια σάρωσης-ανίχνευσης

Παρασκευάσματα – Χρώσεις

Παρασκευάσματα Συνήθως από Βιολογικά υλικά Ούρα Πτύελα Κόπρανα Αίμα Οφθαλμικό έκκριμα ΕΝΥ Κολπικό έκκριμα κ.α. Αποικίες από καλλιέργεια

Χρησιμότητα άμεσων παρασκευασμάτων Εμπειρική θεραπεία σύμφωνα με τη Gram ή άλλη χρώση Επιλογή θρεπτικών υλικών που θα μπολιαστεί το δείγμα Αξιολόγηση ποιότητας δείγματος Συσχέτιση των αποτελεσμάτων παρασκευάσματος και καλλιέργειας

Παρασκευάσματα Νωπά παρασκευάσματα Φυσιολογικός ορός Ιώδιο Καυστικό κάλιο Λακτοφαινόλη Σινική μελάνη κ.α. Κεχρωσμένα παρασκευάσματα Gram χρώση Ziehl-Neelsen Τρίχρωμη κα

Ούρα Νωπό παρασκεύασμα από ίζημα ούρων (μετά από φυγοκέντρηση) Καταμέτρηση λευκών και ερυθρών αιμοσφαιρίων Παρουσία μικροοργανισμών Στοιχεία μυκήτων (fungal elements) Παράσιτα κ.α.

http://www.parasite-diagnosis.ch/schistourinarydia

Πτύελα Καταλληλότητα δείγματος Είδος μικροοργανισμού Ποσότητα μικροοργανισμού Στοιχεία μυκήτων

Αξιολόγηση καταλληλότητας δείγματος - ΠΜΝ> 25/κ.ο.π. - επιθηλιακά κύτταρα< 10κ.ο.π.

Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenzae 

Staphylococcus aureus

κόπρανα -γενική κοπράνων -παρασιτολογική ( φ.ο., lugol, τρίχρωμη) Ancylostoma duodenale Entamoeba histolytica Giardia lamblia

Εγκεφαλονωτιαίο υγρό Μέτρηση έμμορφων στοιχείων (ΠΜΝ, Ερυθρά) Αναζήτηση μικροβίων

Κολπικό έκκριμα Διαταραχή Φυσιολογικής χλωρίδας ΠΜΝ Μύκητες παράσιτα

ΑΜΕΣΟ ΝΩΠΟ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΜΑ

Ανάδειξη σχήματος

Ανάδειξη διάταξης

Είδη χρώσεων Απλές χρώσεις Διαφορικές χρώσεις (χρήση 1 χρωστικής) απεικόνιση μορφολογίας σχήματος και διάταξης Διαφορικές χρώσεις (χρήση 2 χρωστικών με ενδιάμεσο αποχρωματισμό) Αναγνώριση Απεικόνιση κάποιου σχηματισμού Gram Οξεοάντοχη

ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΜΟΝΙΜΟΠΟΙΗΣΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΜΟΝΙΜΟΠΟΙΗΣΗΣ Η μονιμοποίηση των μικροοργανισμών σε αντικειμενοφόρο πλάκα. Σκοτώνει τα μικρόβια. Συντηρεί τα διάφορα μέρη των μικροβίων 1. θέρμανση σε φλόγα 2. εφαρμογή διαλύματος μεθυλικής αλκοόλης για 1 λεπτό

ΧΡΩΣΗ (STAIN) Είναι η σήμανση των μικροοργανισμών με έγχρωμες ουσίες προκειμένου να αποκαλύψουμε τις δομές τους. Μεταβολή του δείκτη διάθλασης των δειγμάτων από τον δείκτη διάθλασης του μέσου Αποτέλεσμα: οι ακτίνες φωτός που περνούν από το κεχρωσμένο δείγμα ακολουθούν διαφορετική πορεία από αυτές που περνούν από το μέσο τους

Χρωστικές Άλατα που αποτελούνται από ένα θετικό και ένα αρνητικό ιόν, ένα από τα οποία είναι έγχρωμο και ονομάζεται χρωμοφόρο Βασικές χρωστικές: το χρώμα βρίσκεται στο θετικό ιόν (κρυσταλλικό ιώδες, κυανό του μεθυλενίου) Όξινες χρωστικές: το χρώμα βρίσκεται στο αρνητικό ιόν (ηωσίνη, φουξίνη, νιγροσίνη) Επειδή τα βακτήρια είναι ελαφρώς αρνητικά φορτισμένα το έγχρωμο θετικό ιόν σε μια βασική χρωστική έλκεται από τα αρνητικά φορτία του βακτηριακού κυττάρου Οι όξινες χρωστικές δεν προσελκύονται από τους περισσότερους τύπους βακτηρίων επειδή τα αρνητικά ιόντα της χρωστικής απωθούνται από την αρνητικά φορτισμένη βακτηριακή επιφάνεια

Κατηγορίες χρώσεων Απλές Διαφορικές Ειδικές

ΑΠΛΕΣ ΧΡΩΣΕΙΣ Είναι υδατικά ή αλκοολικά διαλύματα μιας βασικής χρωστικής (κυανούν του μεθυλενίου, κρυσταλλικό ιώδες, σαφρανίνη) Δίνεται έμφαση σε ολόκληρο τον οργανισμό και γίνονται ορατές οι βασικές δομές και τα κύτταρα του.

Χρωστική μπλε του μεθυλενίου

ΔΙΑΦΟΡΙΚΕΣ ΧΡΩΣΕΙΣ Αντιδρούν διαφορετικά στα διάφορα είδη μικροβίων. ΔΙΑΦΟΡΙΚΕΣ ΧΡΩΣΕΙΣ Αντιδρούν διαφορετικά στα διάφορα είδη μικροβίων. Διάκριση βακτηρίων (Gram χρώση, οξεάντοχη χρώση)

Χρώση Gram Αναπτύχθηκε το 1884 από το Δανό βακτηριολόγο Hans Christian Gram Μία από τις πιο χρήσιμες χρώσεις της Μικροβιολογίας επειδή ταξινομεί τα βακτήρια σε δύο μεγάλες κατηγορίες. Gram (+), Gram (-). Ανακάλυψε ότι το κρυσταλλικό ιώδες χρωματίζει κάποια βακτήρια ενώ άλλα όχι μετά τον αποχρωματισμό.

Χρώση Gram Gram-θετικά ταξινομούνται ως τα βακτήρια που διατηρούν το κρυσταλλικό ιώδες και το ιωδιούχο διάλυμα μετά τον αποχρωματισμό με αλκοόλη Gram-αρνητικά ταξινομούνται τα βακτήρια που αποχρωματίζονται Αντιδρούν διαφορετικά λόγω της διαφορετικής δομής των κυτταρικών τοιχωμάτων τους

Gram χρώση Τα θετικά κατά Gram έχουν υψηλή περιεκτικότητα σε πεπτιδογλυκάνη στο τοίχωμα τους Τα αρνητικά κατά Gram βακτήρια έχουν εξωτερική μεμβράνη που καλύπτει την λεπτή στοιβάδα πεπτιδογλυκάνης

ΕΙΔΙΚΕΣ ΧΡΩΣΕΙΣ Χρησιμοποιούνται για την ανάδειξη συγκεκριμένων τμημάτων των μικροοργανισμών ή οργανιδίων όπως ενδοσπόρια, μαστίγια, έλυτρα