Mικτή Λεμφοκυτταρική Αντίδραση (Mixed Lymphocyte Reaction; MLR) Άσκηση 13 Mικτή Λεμφοκυτταρική Αντίδραση (Mixed Lymphocyte Reaction; MLR) Ράνια Τσιτσιλώνη Λίλα Φωτεινοπούλου

Μέθοδοι προσδιορισμού HLA αντιγόνων Προϋποθέσεις: Τ λεμφοκύτταρα (τυποποίηση για τα τάξης Ι) και Β λεμφοκύτταρα (τυποποίηση για τα τάξης ΙΙ) πολυκλωνικοί ή μονοκλωνικοί αντι-HLA αντιοροί Μέθοδοι που χρησιμοποιούνται: μικρολεμφοκυτταρική δοκιμασία (ορολογική τυποποίηση) μοριακές μέθοδοι (PCR) μικτή λεμφοκυτταρική αντίδραση (MLR)

Μικρολεμφοκυτταρική δοκιμασία

Μοριακή τυποποίηση με χρήση PCR PCR-SSP PCR-SSO

Tα επίπεδα της HLA τυποποίησης Χαμηλής ακρίβειας: σε επίπεδο ορολογικής ειδικότητας (πιο αλληλόμορφο εκφράζεται) Ενδιάμεσης ακρίβειας: σε επίπεδο ομάδας αλληλομόρφων Υψηλής ακρίβειας: σε επίπεδο αλληλομόρφου (νουκλεοτιδική αλληλουχία) όνομα αλληλομόρφου διαχωριστικό μεταξύ γονιδίου και του ονόματος του αλληλομόρφου γονίδιο διαχωριστικό κατάληξη που υποδεικνύει διαφορές στην έκφραση διαχωριστικά Πεδίο 1: ομάδα αλληλομόρφου Πεδίο 2: ειδική HLA πρωτεΐνη Πεδίο 4: χρησιμοποιείται για να δείξει διαφορές στη μη κωδική περιοχή Πεδίο 3: χρησιμοποιείται για να δείξει μία συνώνυμη αντικατάσταση μέσα στην κωδική περιοχή

Οι υπο-ομάδες των αλληλομόρφων DR3 DR17 DRB1*0301 DRB1*0302 DR18 DRB1*0303

Η αρχή της MLR δότης δέκτης

Τι είναι η MLR Τι μας δείχνει η MLR In vitro μέθοδος με την οποία εξετάζουμε τη λειτουργική κατάσταση του ανοσοποιητικού συστήματος ελέγχοντας τη δυνατότητά του να απαντά σε αυτόλογα ή ετερόλογα αντιγόνα Μέθοδος ποσοτικοποίησης της συμβατότητας HLA τάξης ΙΙ Τι μας δείχνει η MLR την ικανότητα ενεργοποίησης των Τ κυττάρων και των μονοκυττάρων την ικανότητα δημιουργίας Τc και Ts λεμφοκυττάρων την ικανότητα ρύθμισης ανοσολογικών λειτουργιών (πχ. παραγωγή Ab) την ικανότητα απάντησης των Τ λεμφοκυττάρων σε μιτογόνα ή αλλοαντιγόνα την ικανότητα παραγωγής σημαντικών κυτταροκινών (πχ IL-2, IL-1, IFNs, TNFs)

Διαφορά με την in vivo κατάσταση Τύποι MLR Μονόδρομη Αμφίδρομη Αυτόλογη Ετερόλογη Διαφορά με την in vivo κατάσταση μεταβάλλουμε την αριθμητική σχέση των κυττάρων μεταξύ τους (Τ λεμφοκύτταρα : μονοκύτταρα = 1:1)

Μικτή λεμφοκυτταρική αντίδραση

Δ. Πειραματική διαδικασία Βάζουμε από 2 ml εναιώρημα σπληνοκυττάρων Balb/c και 2 ml C57BL/6 στα πλαστικά σωληνάρια (από το R1 στο S1 και από το R2 στο S2) Προσθέτουμε 50 μl μιτομυκίνης C, επωάσουμε για 45 min σε κλίβανο 37οC με ανακίνηση ανά 15 min. Γεμίζουμε τα σωληνάρια με PBS Φυγοκέντρηση : 1200 rpm για 5 min (2 φορές) Επαναιωρούμε σε 1,5 ml θρεπτικού υλικού Μετράμε τα κύτταρα-απαντητές (R1) (50 μl κύτταρα + 50 μl Trypan blue στο γυάλινο σωληνάκι) στη Neubauer. Αραιώνουμε με θρεπτικό υλικό ώστε η συγκέντρωση να είναι 2 x 106 κύτταρα/ml. Σε πλάκα 96 φρεατίων τοποθετούμε: 100 μl από τα κύτταρα-απαντητές (R1) σύμφωνα με τον πίνακα 13.1 100, 50 ή 20 μl από τα κύτταρα-διεγέρτες (S1 και S2) συμπληρώνουμε με θρεπτικό υλικό μέχρι τελικού όγκου 200 μl/φρεάτιο ΠΡΟΣΟΧΗ: βάζουμε πάντα θετικούς (σειρά Β) και αρνητικούς (σειρά Α) μάρτυρες Βάζουμε την πλάκα για επώαση σε κλίβανο 37οC, 5% CO2 για 5 ημέρες

Πίνακας 13.1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C D E F G H R1 100 μl S1 100 μl S2 100 μl + IL-2 S1 20 μl S1 50 μl S2 20 μl S2 50 μl υπόβαθρο max απάντηση αυτόλογη MLR ετερόλογη MLR 5:1 2:1 1:1

Αποτελέσματα – Υπολογισμοί Για το φυλλάδιό σας Υπολογίζουμε μέσο όρο cpm θετικών και αρνητικών μαρτύρων και των υπό εξέταση δειγμάτων (αφαιρούμε από όλα τους αντίστοιχους αρνητικούς μάρτυρες) Γραφική παράσταση αναλογίας κυττάρων-απαντητών προς διεγέρτες συναρτήσει των cpm για τις ομάδες R1-S1 (αυτόλογη MLR) και R1-S2 (ετερόλογη MLR) Πού παρατηρείτε μεγαλύτερη ικανότητα πολλαπλασιασμού και γιατί; Τι παρατηρείται στα φρεάτια όταν προσθέσατε IL-2;