Εργαστήριο Συγκριτική Ανοσολογία ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΔΡΑΣΤΙΚΩΝ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΩΝ ΤΩΝ ΟΥΔΕΤΕΡΟΦΙΛΩΝ Ρ. Τσιτσιλώνη, Σ. Παπαβασιλείου, Π. Σαμαρά

Εισαγωγή για τα Ουδετερόφιλα o πολυπληθέστερος λευκοκυτταρικός πληθυσμός ανήκουν στα πολυμορφοπύρηνα ή κοκκιοκύτταρα πρώτη γραμμή άμυνας έναντι μολύνσεων έντονη φαγοκυτταρική ικανότητα ενδοκυτταρική καταστροφή μικροοργανισμών, μέσω της παραγωγής ενεργών ριζών (ROS) κυτταροτοξική δράση έναντι καρκινικών κυττάρων

Θεμελιώδεις αντιμικροβιακές ιδιότητες Τα ουδετερόφιλα είναι ικανά : να εγκολπώνουν τους μικροοργανισμούς & να τους αποικοδομούν, μέσω των λυτικών τους ενζύμων Aπελευθερώνουν απότομα μεγάλες ποσότητες υπεροξειδίου του υδρογόνου μέσω της διαδικασίας της «αναπνευστικής έκρηξης» (respiratory burst). Συγκεκριμένα, το ένζυμο NADPH οξειδάση παράγει υπεροξείδιο, το οποίο αυθόρμητα συνδυάζεται με άλλα μόρια και δημιουργεί δραστικές ελεύθερες ρίζες.

Διαταραχές των ουδετερόφιλων Αφορούν: ανωμαλίες στον αριθμό, την προσκόλληση, τη μετακίνηση, τα κοκκία & την αντιμικροβιακή δραστηριότητα μία από τις σοβαρότερες διαταραχές είναι η μείωση του αριθμού των ουδετερόφιλων σε χαμηλά επίπεδα (ουδετεροπενία), με αποτέλεσμα το άτομο να κινδυνεύει από μολύνσεις. παρατηρείται συχνά σε ασθενείς με καρκίνο λόγω των χημειοθεραπευτικών σχημάτων που ακολουθούν αναστρέφεται με χορήγηση αυξητικών παραγόντων

Απομόνωση των ουδετερόφιλων επιστίβαξη περιφερικού αίματος σε διάλυμα Ficoll Histopaque φυγοκέντρηση δημιουργία 4 στιβάδων: πλάσμα – μονοπύρηνα – Ficoll - ερυθροκύτταρα/κοκκιοκύτταρα απόρριψη των τριών πρώτων στιβάδων λύση ερυθρών αιμοσφαιρίων εκτίμηση συγκέντρωσης και βιωσιμότητας κυττάρων

Ι. Δοκιμασία φαγοκυττάρωσης σωματιδίων Zymosan τοποθετούμε τα αντιδραστήρια στα σωληνάρια (Ζ 1-3) ΠΡΟΣΟΧΗ: τα ουδετερόφιλα από το σωληνάριο με τα 5x106 κύτταρα/ml επώαση (60-90 min) σε κλίβανο 37οC προσθέτουμε 20 μl PFA, επώαση (10 min) στους 4οC φυγοκέντρηση (1600 στροφές, 5 λεπτά) Αφαιρούμε 80 μl από το υπερκείμενο και προσθέτουμε 50 μl ΗΒSS-g παρατήρηση σε οπτικό μικροσκόπιο μέτρηση της % αναλογίας των θετικών κυττάρων (τουλάχιστον 50 κύτταρα, βέλτιστα 100 κύτταρα)

ΙΙ. Δοκιμασία αναγωγής του Nitro Blue Tetrazolium (NBT) τοποθετούμε τα αντιδραστήρια στα σωληνάρια (Ν 1-3) ΠΡΟΣΟΧΗ: τα ουδετερόφιλα από το σωληνάριο με τα 2x106 κύτταρα/ml επώαση (10 min) σε κλίβανο 37οC επώαση (10 min) σε θερμοκρασία δωματίου προσθέτουμε 20 μl PFA παρατήρηση σε οπτικό μικροσκόπιο μέτρηση της % αναλογίας των θετικών-μπλε κυττάρων (τουλάχιστον 50 κύτταρα, βέλτιστα 100 κύτταρα)

ΙΙΙ. Δοκιμασία αναγωγής του κυτοχρώματος C τοποθετούμε τα αντιδραστήρια στα σωληνάρια (C 1-3) ΠΡΟΣΟΧΗ: τα ουδετερόφιλα από το σωληνάριο με τα 5x106 κύτταρα/ml επώαση (20 min) σε κλίβανο 37οC - πάγο φυγοκέντρηση (800 στροφές, 5 λεπτά) αφαιρούμε το υπερκείμενο (400 μl) φωτομέτρηση υπερκειμένου σε UV (535 και 550 nm) υπολογισμός (OD550-OD535) x 1000

Αξιολόγηση Αποτελεσμάτων ΦΑΓΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑ % ΠΟΣΟΣΤΟ ΘΕΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΕΝΔΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΠΑΡΑΓΩΓΗ Ο2- % ΠΟΣΟΣΤΟ ΘΕΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ 9