ΑΝΟΣΟΣΤΥΠΩΜΑ ΚΑΤΑ WESTERN ΑΝΟΣΟΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗ & ΑΝΟΣΟΣΤΥΠΩΜΑ ΚΑΤΑ WESTERN

Προετοιμασία του Πρωτεϊνικού Δείγματος Για να αναλυθούν οι πρωτεΐνες με ανοσοστύπωμα κατά Western ή ανοσοκατακρήμνιση θα πρέπει να εκχυλιστούν από κύτταρα ή ιστό αλλά και να διατηρηθούν σε διάλυμα. Αυτό επιτυγχάνεται χρησιμοποιώντας απορρυπαντικά όπως Triton X-100, NP-40, SDS κ.λ.π. συνήθως σε περιεκτικότητα 1% στο κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα που μπορεί να περιλαμβάνει 150 mM NaCl, 25 mM Tris-HCI, 2 mM EDTA και αναστολείς πρωτεασών. Ιδιαίτερα στην περίπτωση της ανοσοκατακρήμνισης, η επιλογή του απορρυπαντικού είναι πολύ σημαντική αφού οι συνθήκες πρέπει να είναι τέτοιες ώστε να επιτρέπουν τη δέσμευση του αντισώματος στο αντιγόνο και όταν μελετούνται πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις το απορρυπαντικό θα πρέπει να τις διατηρεί.

ΥΠΟΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΕΝΤOΠΙΣΜΟΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ  ΕΠΙΛΟΓΗ ΔΙΑΛΥΜΑΤΟΣ ΟΜΟΓΕΝΟΠΟΙΗΣΗΣ ΟΛΙΚΟ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑ NP-40 or RIPA ΚΥΤΤΑΡΟΠΛΑΣΜΑ (διαλυτή)Tris-HCl ΚΥΤΤΑΡΟΠΛΑΣΜΑ (κυτ/σκελετος)Tris-Triton ΜΕΜΒΡΑΝΟΣΥΝΔΕΟΜΕΝΗ NP-40 or RIPA ΠΥΡΗΝΙΚΗRIPA / ΥΠΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΚΛΑΣΜΑΤΩΣΗ * ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑΚΟ ΚΛΑΣΜΑ  RIPA / ΥΠΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΚΛΑΣΜΑΤΩΣΗ ΕΠΙΤΥΓΧΑΝΕΤΑΙ ΕΜΠΛΟΥΤΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΜΕ ΚΛΑΣΜΑΤΩΣΗ ~ ΑΝ ΥΠΑΡΧΕΙ ΥΠΟΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΕΝΤΟΠΙΣΜΟΣ !!! ΧΑΜΗΛΑ ΕΠΙΠΕΔΑ ΕΚΦΡΑΣΗΣ π.χ. πυρηνική πρωτεϊνη Nonidet-P40 (NP40) διάλυμα: κυτ/κες, μεμβρ/νες, ολική εκχύλιση ΜΗ ΔΙΑΛΥΤΗ-ΣΥΣΣΩΜΑΤΩΜΑΤΑ  ΔΙΑΛΥΜΑ RIPA [ιονικά απορρυπαντικά]  διαλυτοποίηση πρωτεϊνών

RIPA buffer (Radio Immuno Precipitation Assay buffer) 50 mM Tris/HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% NP-40, 0.1% SDS  ολικό κυτταρικό εκχύλισμα, μεμβρανοσυνδεόμενες πρωτεϊνες κ πυρηνικό κλάσμα (vs διαλύματα NP- 40 / Triton X100) Προκειμένου να διαφυλαχθούν αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών ή να ελαχιστοποιηθεί η πιθανότητα μετουσίωσής τους (διαφύλαξη επιτόπου που αναγνωρίζει συγκεκριμένο αντίσωμα) απαιτείται χρήση διαλύματος ομογενοποίησης που δε θα περιέχει ιονικά απορρυπαντικά (π.χ. SDS) ούτε και μη-ιονικά (π.χ. Triton X-100). Στην περίπτωση αυτή η κυτταρική λύση επιτυγχάνεται με μηχανικό τρόπο (ομογ/της Dounce homogenizer ή βελόνα)  απλό διάλυμα Tris.

Παράλληλα με τη λύση λαμβάνουν χώρα πρωτεόλυση, αποφωσφορυλίωση και μετουσίωση . Ελαχιστοποιούνται με φύλαξη των δειγμάτων στους 4°C και χρήση κατάλληλων αναστολέων (cocktail αναστολέων εμπορίου). ΑΝΑΣΤΟΛΕΑΣ  ειδικός για πρωτεάση / φωσφατάση Aprotinin  Trypsin, Chymotrypsin, Plasmin Leupeptin Lysosomal Pepstatin A Aspartic proteases PMSF Serine, Cysteine proteases EDTAMetalloproteases [Mg++ and Mn++] EGTA Metalloproteases [Ca++] NaF  Serine/Threonine phosphatases Na OrthovanadateTyrosine phosphatases

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ Bradford assay, Lowry assay ή BCA assay. Bovine serum albumin (BSA)  protein standard. ΦΥΛΑΞΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ -20°C ή -80°C. ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ ΑΝΑΓΝΩΡΙΖΟΥΝ ΕΠΙΤΟΠΟ [ΚΑΛΥΨΗ ΛΟΓΩ ΣΤΕΡΕΟΔΙΑΤΑΞΗΣ]  ΠΡΟΚΕΙΜΕΝΟΥ ΝΑ ΓΙΝΕΙ Η ΑΝΑΓΝΩΡΙΣΗ-ΣΥΝΔΕΣΗ ΠΡΕΠΕΙ ΝΑ «ΞΕΔΙΠΛΩΘΕΙ» Η ΠΡΩΤΕΪΝΗ. ΜΕΤΟΥΣΙΩΣΗ – ΔΙΑΛΥΜΑ ΦΟΡΤΩΣΗΣ (loading buffer) ΜΕ ΑΝΙΟΝΙΚΟ ΑΠΟΡΡΥΠΑΝΤΙΚΟ [ sodium dodecyl sulfate (SDS) ] ΚΑΙ ΒΡΑΣΜΟ 95-100°C 3 min. Standard loading buffer 2X Laemmli buffer {Nature, 1970 Aug 15; 227 (5259): 680-5}. Laemmli 2X buffer: 4%(w/v) SDS, 10%(v/v) 2-mercaptoehtanol, 20%(v/v) glycerol, 0.004%(w/v) bromophenol blue, 0.125 M Tris/HCl pH 6.8 MH MEΤΟΥΣΙΩΤΙΚΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ : ΠΑΡΑΛΕΙΠΕΤΑΙ SDS ΚΑΙ Ο ΒΡΑΣΜΟΣ ! ΠΑΡΑΛΕΙΠΟΝΤΑΙ ΕΠΙΣΗΣ ΑΝΑΓΩΓΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ (ΟΞΕΙΔΩΜΕΝΗ ΜΟΡΦΗ – ΚΑΤΑΛΟΙΠΑ ΚΥΣΤΕΪΝΗΣ) π.χ. ß-mercaptoethanol και DTT (μη αναγωγικές συνθήκες).

ΑΝΟΣΟΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗ ΜΙΑΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ Εκχύλιση των πρωτεϊνών κυττάρων ή ιστού σε διάλυμα με κατάλληλο απορρυπαντικό Εκχυλίσματα πρωτεϊνών επωάζονται στους 4οC με αντίσωμα ενάντια σε συγκεκριμένη πρωτεΐνη για 2-16 ώρες. Προστίθενται σφαιρίδια αγαρόζης καλυμμένα με πρωτεΐνη Α ή G που δεσμεύουν το αντίσωμα με μεγάλη συγγένεια.

ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΤΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΓΙΑ ΑΝΑΛΥΣΗ ΣΕ ΠΗΚΤΩΜΑ ΠΟΛΥΑΚΡΥΛΑΜΙΔΗΣ Τα σύμπλοκα αντιγόνου-αντισώματος-σφαιριδίων κατακρημνίζονται με φυγοκέντρηση και διαλυτοποιούνται σε διάλυμα που περιέχει (σε τελικές συγκεντρώσεις) Α. 3%(w/v) SDS που αποδιατάσσει τις πρωτεΐνες και τους προσδίδει αρνητικό φορτίο Β. 10 mM EDTA για να ανασταλούν οι πρωτεάσες Γ. 10 mM EGTA για να ανασταλούν οι πρωτεάσες Δ. 50%(v/v) γλυκερόλη που βοηθά στο φόρτωμα του πρωτεϊνικού δείγματος στο πηγάδι του πηκτώματος της πολυακρυλαμίδης Ε. Χρωστική της βρωμοφαινόλης μπλε που βοηθά στο φόρτωμα του πρωτεϊνικού δείγματος στο πηγάδι του πηκτώματος της πολυακρυλαμίδης (παρακολούθηση μετώπου)

ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΟΥ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ Στη συνέχεια, κατάλληλος όγκος δειγμάτων φορτώνεται στα φρεάτια του πηκτώματος της πολυακρυλαμίδης (Bradford). Αντίσωμα Αντιγόνο Ακολουθεί ανίχνευση του αντιγόνου με αυτοραδιογραφία ή ανοσοστύπωμα κατά Western.

ΣΥΓΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗ ΔΥΟ Η’ ΠΕΡΙΣΣΟΤΕΡΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Εκχύλιση των πρωτεϊνών κυττάρων ή ιστού σε διάλυμα που περιέχει κατάλληλο απορρυπαντικό Εκχυλίσματα πρωτεϊνών επωάζονται στους 4οC με αντίσωμα ενάντια σε συγκεκριμένη πρωτεΐνη για 2-16 ώρες. Προστίθενται σφαιρίδια αγαρόζης καλυμμένα με πρωτεΐνη Α ή G που δεσμεύουν το αντίσωμα με μεγάλη συγγένεια.

ΣΥΓΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗ ΔΥΟ Η’ ΠΕΡΙΣΣΟΤΕΡΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Στη συνέχεια, κατάλληλος όγκος δειγμάτων φορτώνεται στα φρεάτια του πηκτώματος της πολυακρυλαμίδης. Αντίσωμα Αντιγόνο 5. Ανίχνευση του αντιγόνου με αυτοραδιογραφία ή ανοσοστύπωμα κατά Western.

ΑΝΟΣΟΣΤΥΠΩΜΑ ΚΑΤΑ WESTERN Πήκτωμα επιστοίβαξης: 3-5% (w/v) ακρυλαμίδη, pH 6.8. Επιτρέπει τη συγκέντρωση όλων των πρωτεϊνών σε μια γραμμή/ζώνη εκκίνησης στο πάνω μέρος του πηκτώματος διαχωρισμού. Πήκτωμα διαχωρισμού: >6% ακρυλαμίδη, pH 8.8. Επιτρέπει το διαχωρισμό των πρωτεϊνών ανάλογα με το ΜΒ τους και τη δομή τους.

ΑΝΟΣΟΣΤΥΠΩΜΑ ΚΑΤΑ WESTERN Η ηλεκτροφορητική κινητικότητα των πρωτεϊνών είναι αντιστρόφως ανάλογη του ΜΒ τους. Χρώση με Coomassie brilliant blue Δείγματα Πρωτεϊνικοί δείκτες

ΑΝΟΣΟΣΤΥΠΩΜΑ ΚΑΤΑ WESTERN ΗΜΙ-ΣΤΕΓΝΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΑΠΟ ΤΟ ΠΗΚΤΩΜΑ ΑΚΡΥΛΑΜΙΔΗΣ ΣΤΟ ΦΙΛΤΡΟ ΝΙΤΡΟΚΥΤΤΑΡΙΝΗΣ Κατεύθυνση μεταφοράς - κάθοδος Φύλλα Whatman Πήκτωμα ακρυλαμίδης Νιτροκυτταρίνη Φύλλα Whatman + άνοδος

ΠΗΚΤΩΜΑ ΠΟΛΥΑΚΡΥΛΑΜΙΔΗΣ ΧΡΩΣΜΕΝΟ ΜΕ COOMASIE BRILLIANT BLUE ΠΡΙΝ ΚΑΙ ΜΕΤΑ ΤΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΣΕ ΦΙΛΤΡΟ ΝΙΤΡΟΚΥΤΤΑΡΙΝΗΣ

ΑΝΟΣΟΣΤΥΠΩΜΑ ΚΑΤΑ WESTERN Μεταφορά των πρωτεϊνών από το πήκτωμα ακρυλαμίδης σε φίλτρο νιτροκυτταρίνης H Χρώση με Ponceau S επαληθεύει ότι οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν από το πήκτωμα ακρυλαμίδης στο φίλτρο νιτροκυτταρίνης

ΑΝΟΣΟΣΤΥΠΩΜΑ ΚΑΤΑ WESTERN Φίλτρο νιτροκυτταρίνης όπου έχουν μεταφερθεί οι πρωτεΐνες Επώαση με το πρώτο αντίσωμα και δέσμευσή του με το αντιγόνο Ανίχνευση της πρωτεΐνης Επώαση με το δεύτερο αντίσωμα (συζευγμένο) HRP H2O2 + DAB +

ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΜΑΖΑΣ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ a b Rf = a / b Rf : Είναι ο λόγος της απόστασης που έχει διατρέξει μια πρωτεΐνη μέσα στο πήκτωμα της πολυακρυλαμίδης προς την απόσταση που έχει διατρέξει η χρωστική της βρωμοφαινόλης μπλε (μέτωπο).

ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΜΑΖΑΣ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Για κάθε πρωτεϊνικό δείκτη υπολογίζουμε την τιμή Rf και το λογάριθμο της μοριακής του μάζας. Στη συνέχεια, κατασκευάζουμε αντίστοιχη πρότυπη καμπύλη και προσδιορίζουμε μέσω της τιμής Rf της ζητούμενης πρωτεΐνης και τη Μοριακή της Μάζα. logMΜ Rf

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Η μεμβράνη πλένεται (3 Χ 5 λεπτά το κάθε πλύσιμο) με 20 ml TBS-T Η μεμβράνη επωάζεται για 60 λεπτά ή Ο/Ν με αντίσωμα ενάντια στη προς μελέτη πρωτεΐνη σε θερμοκρασία δωματίου ή 4oC. 3. Η μεμβράνη πλένεται (3 Χ 5 λεπτά) με 20 ml TBS-Tween 0.05% (v/v) Η μεμβράνη επωάζεται για 45-60 λεπτά με το δεύτερο αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση σε θερμοκρασία δωματίου 5. Η μεμβράνη πλένεται (3 Χ 5) με 20 ml TBS-T Στη μεμβράνη προστίθενται 10 ml υποστρώματος της υπεροξειδάσης για ένα λεπτό Το φως που εκπέμπεται καταγράφεται είτε με ειδική κάμερα είτε με X-Ray film [ECL-enhanced chemiluminescence].