Συγκριτική Φυσιολογία Ζώων Βιοενεργητική Προσδιορισμός του ΑΤΡ Δομή

Σύνθεση του ΑΤΡ

Σκοπός της άσκησης Α. Μελέτη του μορίου του ΑΤΡ Σκοπός της άσκησης Α. Μελέτη του μορίου του ΑΤΡ Mini Molecular Building system Β. Προσδιορισμός της ριβόζης (αρχικό πρότυπο διάλυμα ATP: 4μmoles/ml) Γ. Προσδιορισμός του φωσφορικού Δ. Χρωματογραφία ιοντικής ανταλλαγής Ενζυμικός προσδιορισμός του ΑΤΡ

Α. Μελέτη του μορίου του ΑΤΡ Mini Molecular Building system

Α. Μελέτη του μορίου του ΑΤΡ Mini Molecular Building system adenine ribose Καταγραφή Επιλογή Κατασκευή των ομάδων χωριστά Ενοποίηση Φωτογράφηση Phosphate groups

Ομάδα 8Α Χχχχχχχχ χχχχχχχχ Χχχχχ χχχχχχχχχχχ Χχχχ χχχχχ

Β. Προσδιορισμός της ριβόζης Σωλήνας Πρότυπο διάλυμα ριβόζης (ml) H2O Δείγμα 1 0,0 3,5 --- 2 0,5 3,0 3 1,0 2,5 4 1,5 2,0 5 7 8 9 1.0 10 Συγκέντρωση ριβόζης στο πρότυπο διάλυμα : 20μg/ml Συγκέντρωση ΑΤΡ στο «δείγμα» 4μmoles/ml /25 = 0.16μmoles/ml

Β. Προσδιορισμός της ριβόζης Το ΑΤΡ υδρολύεται παρουσία θερμού οξέος (HCl) και παράγεται πεντόζη και φωσφορικό οξύ. Η πεντόζη στη συνέχεια αντιδρά με την ορσινόλη και παράγει έγχρωμο σύμπλοκο (επώαση 95°C 20λεπτά) Υπολογισμοί: Πρότυπη καμπύλη ριβόζης, αφού υπολογιστούν τα μmoles ριβόζης σε κάθε σωλήνα Υπολογισμός της ποσότητας (μmoles) ριβόζης στα δείγματα 9-10 (μέσος όρος). Αντιστοιχεί το αποτέλεσμα στο αναμενόμενο; (απόκλιση)

Γ. Προσδιορισμός του φωσφορικού

Γ. Προσδιορισμός του φωσφορικού Ολικό φωσφορικό απομάκρυνση των τριών ομάδων μετά από κατεργασία με PCA (72%), 160º, 2 ώρες και στη συνέχεια επώαση παρουσία H2O, 100º, 10 λεπτά Δείγμα 1 ml μετά από αραίωση 1:20 (4 μmoles/ml/20 = 0.2 μmoles/ml ΑΤΡ) PO4 ???

Γ. Προσδιορισμός του φωσφορικού Ευαίσθητο στο οξύ φωσφορικό Οι δύο τελευταίες εστερικές συνδέσεις είναι ευαίσθητες στο οξύ και υδρολύονται παρουσία H2SO4, 1Ν, 100º, 10 λεπτά Δείγμα 1,5 ml μετά από αραίωση 1:20 (4 μmoles/ml/20 = 0,2 μmoles/ml ΑΤΡ) PO4 ??? Κριτήρια καθαρότητας Προσδιορισμός του λόγου του ολικού φωσφορικού προς το ευαίσθητο στο οξύ φωσφορικό Προσδιορισμός της γραμμομοριακής αναλογίας της κάθε κατηγορίας για κάθε γραμμομόριο ΑΤΡ

Γ. Προσδιορισμός του φωσφορικού Ανόργανο φωσφορικό Πιθανές προσμίξεις του ΑΤΡ είναι το ανόργανο φωσφορικό (η τελευταία ομάδα) που απελευθερώνεται κατά την αποθήκευσή του Δείγμα 0,75 ml χωρίς αραίωση Οι προσμίξεις αυτές θα βρίσκονται και στα υδρολυμένα προϊόντα

Γ. Προσδιορισμός του φωσφορικού Σωλήνας Pi (ml) H2O (ml) Δείγμα (ml) 1 1.5 --- 2 0.3 1.2 3 0.6 0.9 4 5 6 7,8 0.5 1.0 (ATP-PCA) 9,10 1.0 (H2O-PCA) 11,12 1.5 (ATP-H2SO4) 13,14 1.5 (H2O-H2SO4) 15,16 0.75 0.75 (αρχικό διάλυμα)

Προσδιορισμός του φωσφορικού ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΙ Πρότυπη καμπύλη φωσφορικών, μmoles/OD Υπολογισμός του μέσου όρου σε κάθε δείγμα Αφαίρεση του «θορύβου» (σωλ. 15-16) από τα κυρίως δείγματα (7-8, 11-12) Υπολογισμός των μmoles σε κάθε δείγμα, με βάση την πρότυπη. Υπολογισμός των μmoles που αναμένετε με βάση τις αραιώσεις (π.χ. 0.5ml του αρχικού διαλύματος ΑΤΡ, αραιώθηκε στα 10ml , και από αυτό, χρησιμοποιήθηκε από 1ml –σωλήνες 7,8- για τον προσδιορισμό του ολικού φωσφορικού) Σύγκριση Αντιστοιχεί το αποτέλεσμα στο αναμενόμενο; (απόκλιση)

Δ. Χρωματογραφία ιοντικής ανταλλαγής

Δ. Χρωματογραφία ιοντικής ανταλλαγής ATP ADP AMP

Δ. Χρωματογραφία ιοντικής ανταλλαγής Διαλύτης :14cm AMP : 6 cm ATP : --- ADP : 2.4cm _____ Υπολογισμός Rf

Ενζυμικός προσδιορισμός του ΑΤΡ Μοριακός συντελεστής απορρόφησης NADP ε = 6.22×103 Μ-1 cm-1

Ενζυμικός προσδιορισμός του ΑΤΡ

Ενζυμικός προσδιορισμός του ΑΤΡ 1ο στάδιο:φωσφορυλίωση της γλυκόζης

Ενζυμικός προσδιορισμός του ΑΤΡ (1ο και) 2ο στάδιο:αναγωγή του NADP

Δείγματα-διαλυτοποίηση Δείγματα ΑΤΡ, Μάρτιος 2017 V-ολικό Δείγματα-διαλυτοποίηση PCA(ml) «υπερκείμενο» 1:5 Δείκτης(ml) «δείκτης» Tris-KOH(ml) «βάση» 1 Α-σπόνδυλο (πολύχαιτος) 3,5 0,05 4,00 2 Σ-πονδυλωτό (βατράχι) 4,0 4,5 3 Κ-αρδιά αρουραίου 5,0 4 Ιστός 2 (κάματος) 5,5

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Διάλυμα (ml) 1 2 3 0.05 Μ Φωσφορικό ρυθμιστικό, pH 7.5 2.0 Γλυκόζη 0.5M 0.2 0.1M MgCl2 NADP (2mg/ml) 0.1 -- Εξοκινάση Αφυδρογονάση της 6-Ρ-γλυκόζης Η2Ο 0.3 Προσθέτουμε τα διαλύματα σε τρείς κυψελίδες, σύμφωνα με τον πίνακα και φωτομετρούμε στα 340nm, αφού μηδενίσουμε με νερό ως τυφλό.

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Προσθέτουμε 0.2ml από το αρχικό πρότυπο διάλυμα (αραιωμένο 1:1, επομένως :0.4μmoles) και παρακολουθούμε τηv απορρόφηση μέχρι να σταθεροποιηθεί, οπότε την καταγράφουμε. Επαναλαμβάνουμε την ίδια διαδικασία με δύο δείγματα ιστών. Αν χρειαστεί, πρέπει να γίνουν ΠΡΩΤΑ οι απαραίτητες διορθώσεις με βάση τους μάρτυρες 1,2 σε κάθε περίπτωση. Οι υπολογισμοί στηρίζονται στον μοριακό συντελεστή απορρόφησης για το NADP: 6.22×103 Μ-1 cm-1 (λ=340nm)

ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΙ β) Για τους ιστούς: 6.22Χ1 mM ATP = OD 1. Συγκέντρωση : 2. Ποσότητα: συγκέντρωση Χ 3ml / 1000 =Α μmoles V(υπερκ) Α 5 ml/gr 0,2ml =μmoles/gr ιστού α) Για το πρότυπο διάλυμα : είναι η ποσότητα 0,4 μmoles? Εάν όχι, ποια είναι η απόκλιση? V(ολικό) x x Υπολογίζουμε τον αριθμό γραμμομορίων ΑΤΡ, στο πρότυπο διάλυμα και, στα δείγματα διορθώνοντας με την απόκλιση.