Ανασκόπηση ανοσολογικών τεχνικών Άσκηση 1 Ανασκόπηση ανοσολογικών τεχνικών Ράνια Τσιτσιλώνη

ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ-ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ Αντιγόνα-Ανοσογόνα-Ανοχογόνα Δυναμική αλληλεπιδράσεων αντιγόνου-αντισώματος Αντιδράσεις κατακρήμνισης σε υγρό μέσο σε πήκτωμα Αντιδράσεις συγκόλλησης άμεση έμμεση ή παθητική ανασταλτική Αντιδράσεις με τη χρησιμοποίηση επισημασμένου αντιγόνου ή αντισώματος RIA ELISA Western blotting Ανοσοφθορισμός-κυτταρομετρία ροής Αντιδράσεις του συμπληρώματος Μέθοδοι προσδιορισμού των HLA αντιγόνων Πειραματικά μοντέλα (in vivo) σε ζώα

Ι. Bασικές έννοιες - Ορισμοί Αντιγόνο (Antigen): ουσία που συνδέεται ειδικά με ένα μόριο αντισώματος ή με τον επιφανειακό υποδοχέα των δραστικών Τ λεμφοκυττάρων και μπορεί να αποτελέσει στόχο της ανοσολογικής απάντησης Ανοσογόνο (Immunogen): ουσία που μπορεί να προκαλέσει την παραγωγή αντισωμάτων ή/και δραστικών Τ λεμφοκυττάρων, δηλ. επάγει ανοσολογική απάντηση Ανοχογόνο (Tolerogen): ουσία που δεν μπορεί να ενεργοποιήσει ικανό αριθμό λεμφοκυττάρων και επάγει ανοχή (μη αντιδραστικότητα). Αποτυγχάνει να προκαλέσει ειδική ανοσολογική απάντηση αλλά και αναστέλλει την λεμφοκυτταρική ενεργοποίηση σε μεταγενέστερες χορηγήσεις της ανοσογονικής μορφής της ίδιας ουσίας.

Ανοσολογική απάντηση – ανοχή - άγνοια

Ανοσογονικότητα των αντιγόνων

Τι επηρεάζει την ανοσογονικότητα ενός μορίου Ι. Παράγοντες που αφορούν το αντιγόνο ιδιότητα διάκρισης του μορίου ως ξένου μοριακό μέγεθος χημική δομή και ετερογένεια δυνατότητα διάσπασης του μορίου από τα ένζυμα των APC ΙΙ. Παράγοντες που αφορούν τον οργανισμό γενετικοί παράγοντες δόση του αντιγόνου οδός χορήγησης του αντιγόνου χρήση ανοσολογικών προσθετικών (ανοσοενισχυτικών)

Μοριακά βάρη γνωστών αντιγόνων Αντιγόνο Μοριακό βάρος (σε Da) Γάμμα σφαιρίνη βοός (ΒGG) 150.000 Αλβουμίνη ορού βοός 69.000 Φλαγγελίνη (μονομερές) 40.000 Λυσοζύμη αυγού όρνιθας (HEL) 15.000 Αιμοκυανίνη (KLH) > 2.000.000 Οβαλβουμίνη (OVA) 44.000 Mυοσφαιρίνη σπέρματος φάλαινας (SWM) 17.000 Τοξοειδές τετάνου (TT) 150.000 ΜΒ > 100 kDa: συνήθως ανοσογονικές ουσίες

Σημασία δομής και ετερογένειας πρωτεΐνες και πολυσακχαρίτες λιπίδια και νουκλεϊκά οξέα συνθετικά πολυπεπτίδια από >2-3 αα ανοσογονικά μόρια μη ανοσογονικά μόρια συνθετικά πολυπεπτίδια από 1 αα πεπτίδια με αρωματικά κατάλοιπα (Tyr)

Η σημασία δόσης και οδού χορήγησης του Ag (ανοχογόνο)

Τρόπος δράσης γνωστών ανοσοενισχυτικών

Η Θεωρία των Πλευρικών Αλυσίδων (παραγωγή και δράση των αντισωμάτων) P. Ehrlich, Proc. R. Soc. London, 66:424, 1900

Η Θεωρία της Κλωνικής Επιλογής

Η συμπληρωματική σχέση αντιγόνου-αντισώματος σχέση «κλειδιού-κλειδαριάς» 15-22 αμινοξέα του Ag συνδέονται με το Ab σύνδεση με δεσμούς Η+, ιονικές και υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις

Είδη επιτόπων των Β κυττάρων Γραμμικός Διαμορφωτικός

Δημιουργία Τ επιτόπων ενδοκυττάρωση Ag επεξεργασία Αg σύνδεση με MHC μόρια παρουσίαση επιτόπου αναγνώριση από TCR σύνδεση MHC-πεπτίδιο + TCR ενεργοποίηση Τ κυττάρου

Παρουσίαση Τ επιτόπων MHC-περιορισμός (MHC restriction)

Ιδιότητες Β και Τ επιτόπων Χαρακτηριστικό Β κύτταρα Τ κύτταρα Αλληλεπίδραση με το αντιγόνο Εμπλέκει το διμερές σύμπλεγμα μεμβρανικής Ig και Ag Εμπλέκει το τριμερές σύμπλεγμα υποδοχέα των Τ κυττάρων, Ag και MHC μορίου Δέσμευση διαλυτού αντιγόνου Ναι Οχι Εμπλοκή των MHC μορίων Δεν απαιτείται Απαιτείται για να εκθέσουν το επεξεργασμένο αντιγόνο Χημική φύση των αντιγόνων Πρωτεΐνη, πολυσακχαρίτης, λιπίδιο Κυρίως πρωτεΐνες, αλλά και μερικά λιπίδια και γλυκολιπίδια που παρουσιάζονται από MHC-προσομοιάζοντα μόρια Ιδιότητες των επιτόπων Προσιτός, υδρόφιλος, ευκίνητα πεπτίδια που περιέχουν συνεχή ή ασυνεχή αμινοξέα Εσωτερικά γραμμικά πεπτίδια που δημιουργούνται μετά από επεξεργασία του αντιγόνου και προσδένονται στα MHC μόρια

ΙΙ. Δυναμική αλληλεπιδράσεων Αg - Ab k1 Ag + Ab Ag-Ab k2 Συγγένεια (affinity): ένα μόριο Ab με έναν επίτοπο του Ag Δυναμικότητα (avidity): πολλαπλές θέσεις δέσμευσης Ab-Ag

Αλληλεπιδράσεις που συμμετέχουν στην αντίδραση Ag-Ab (75-120)

Τύποι ανοσοαντιδράσεων Αντιδράσεις κατακρήμνισης (ιζηματινοαντιδράσεις) σε υγρό μέσο σε πήκτωμα Αντιδράσεις συγκόλλησης (σχηματισμός κροκίδων) άμεση έμμεση ή παθητική ανασταλτική Αντιδράσεις με τη χρησιμοποίηση επισημασμένου αντιγόνου ή αντισώματος RIA ELISA-ELISPOT Western blotting Ανοσοφθορισμός-Κυτταρομετρία ροής Αντιδράσεις του συμπληρώματος Μέθοδοι προσδιορισμού των HLA αντιγόνων

Ευαισθησία διαφόρων ανοσοδοκιμασιών Δοκιμασία Ευαισθησία (μg Ab/ml) Κατακρήμνιση σε διάλυμα 20-200 Κατακρήμνιση σε πήκτωμα Μancini Ouchterlony   10-50 Ανοσοηλεκτροφόρηση Rocket ηλεκτροφόρηση 2 Αντιδράσεις συγκόλλησης Αμεση Παθητική Ανασταλτική 0.3 0.006-0.06 RIA 0.0006-0.006 ELISA <0.0001-0.001 Ανοσοφθορισμός 1 Κυτταρομετρία ροής 0.06-0.006

III. Αντιδράσεις κατακρήμνισης (ιζηματινοαντιδράσεις) Προϋποθέσεις: το Ab να είναι δισθενές (Fab τμήματα δεν σχηματίζουν ίζημα) το Ag να είναι τουλάχιστον δισθενές (δύο αντίγραφα του ίδιου επιτόπου ή πολλαπλούς επιτόπους που αντιδρούν με πολυκλωνικά Ab) Τύποι αντιδράσεων κατακρήμνισης: σε υγρό μέσο σε πήκτωμα απλή ανοσοδιάχυση προς μια κατεύθυνση διπλή ανοσοδιάχυση προς μια κατεύθυνση διπλή ανοσοδιάχυση προς δύο κατευθύνσεις (Ouchterlony) κυκλοτερής ή ακτινωτή ανοσοδιάχυση (Mancini) ανοσοηλεκτροφόρηση – rocket ηλεκτροφόρηση ανοσοκαθήλωση

Σχηματισμός ιζήματος - Ζώνη ισοδυναμίας

Ανοσοδιάχυση σε πήκτωμα Mancini Ouchterlony

Ανοσοδιάχυση Mancini

Ανοσοδιάχυση Mancini

Καθορισμός της ταυτότητας δύο Ag με τη μέθοδο Ouchterlony Αντίδραση ταυτότητας Αντίδραση μη ταυτότητας Αντίδραση μερικής ταυτότητας

Ανοσοδιάχυση Ouchterlony Παράδειγμα: Ανίχνευση Ab έναντι μικροβίων, αντι-ΕΝΑ Ab σε νοσήματα κολλαγόνου

Ανοσοηλεκτροφόρηση

Ανοσοηλεκτροφόρηση Παράδειγμα: Ανίχνευση μονοκλωνικής πρωτεΐνης

Ανοσοκαθήλωση Ανοσοκαθήλωση ορού ασθενούς με μυέλωμα τύπου IgM λ

Παραδείγματα ανοσοκαθήλωσης Νόσος ελαφριών λ αλυσίδων Μακροσφαιριναιμία Waldenstrom Μυέλωμα ΙgM κ

IV. Αντιδράσεις συγκόλλησης (σχηματισμός κροκίδων) Προϋποθέσεις: το Ab να έχει μεγαλύτερη ισχύ σύνδεσης από τις απωθητικές δυνάμεις μεταξύ των σωματιδίων του Ag να υπάρχει κατάλληλη αναλογία Ag-Ab η παρουσία ηλεκτρολύτη Τύποι αντιδράσεων συγκόλλησης: άμεση συγκόλληση (πχ. ομάδες αίματος) έμμεση ή παθητική συγκόλληση (για διαλυτά Αg, με σωματίδια latex, πχ. μέθοδος Coombs) ανασταλτική συγκόλληση (πχ. test εγκυμοσύνης, ένδειξη/ανίχνευση χρήσης απαγορευμένων ουσιών [κοκαΐνης, ηρωίνης]) Παράδειγμα: Ανίχνευση ρευματοειδούς παράγοντα, CRP, ASTO (στρεπτόκοκκο), Widal (σαλμονέλλα), Wright (βρουκέλλα), VDRL (σύφιλη),

Αμεση μέθοδος Coombs Η παρουσία Ab έναντι των ερυθρών αιμοσφαιρίων του ασθενούς προκαλεί τη συγκόλλησή τους παρουσία αντιδραστηρίου Coombs (αντι-IgG, αντι-IgM, αντι-C)

Αναστολή της συγκόλλησης

V. Αντιδράσεις με χρήση επισημασμένου Ag ή Ab Προϋποθέσεις: η επισήμανση να γίνεται με ουσίες ή μόρια που επιτρέπουν την εύκολη ανίχνευση και τη μέτρησή τους Τύποι αντιδράσεων: RIA ELISA – ELISPOT Western blotting ανoσοφθορισμός – κυτταρομετρία ροής)

Μέθοδος RIA

Παραλλαγές μεθόδου ELISA

Μέθοδος ELISPOT (κυρίως για κυτταροκίνες)

Εφαρμογή μεθόδου ELISPOT ΜΟΝΟΠΥΡΗΝΑ ΠΕΡΙΦΕΡΙΚΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ (PBMC) Μη προ-σκόλληση Καλλιέργεια με 5 μg/mL PHA HLA-typing 2 ώρες προσκόλληση Καλλιέργεια με IL-4, GM-CSF ΜΟΝΟΠΥΡΗΝΑ ΠΕΡΙΦΕΡΙΚΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ (PBMC) προ-σκόλληση + TNFα Καλλιέργεια με 50 μg/mL πεπτίδιο 150.000-300.000/well Restimulation Elispot ΗΜΕΡΑ O ΗΜΕΡΑ 6 ΗΜΕΡΑ 7 ΗΜΕΡΑ 8

Μέθοδος Western blot Παράδειγμα: ανίχνευση Ab έναντι έρπητα τύπου Ι και ΙΙ, AIDS

Ανοσοφθορισμός έμμεσος άμεσος Παράδειγμα: in situ εντοπισμός πρωτεΐνης σε κύτταρα ή ιστούς

Κυτταρομετρία ροής Παράδειγμα: προσδιορισμός υποπληθυσμών κυττάρων σε ανοσολογικά, αιματολογικά και κακοήθη νοσήματα

VI. Αντιδράσεις του συμπληρώματος Προϋποθέσεις: ανιχνεύει Ab στον ορό το σύμπλεγμα Ag-Ab που καταναλώνει το συμπλήρωμα δεν είναι ορατό χρειάζεται δείκτης = αιμολυτικό σύστημα Αιμολυτικό σύστημα = ερυθρά αιμοσφαίρια προβάτου (Ag) και ορός ζώου που περιέχει Ab έναντι των ερυθρών αιμοσφαιρίων του προβάτου ΠΡΟΣΟΧΗ: θετική είναι η αντίδραση που δεν δίνει αιμόλυση Παράδειγμα: Wasserman για σύφιλη

Αιμολυτικό συμπλήρωμα πχ. Wasserman για σύφιλη

VII. Μέθοδοι προσδιορισμού HLA αντιγόνων Προϋποθέσεις: Τ λεμφοκύτταρα (τυποποίηση για τα τάξης Ι) και Β λεμφοκύτταρα (τυποποίηση για τα τάξης ΙΙ) πολυκλωνικοί ή μονοκλωνικοί αντι-HLA αντιοροί Μέθοδοι που χρησιμοποιούνται: μικρολεμφοκυτταρική δοκιμασία (ορολογική τυποποίηση) μοριακές μέθοδοι (PCR) μικτή λεμφοκυτταρική αντίδραση (MLR)

Mικρολεμφοκυτταρική δοκιμασία

Mοριακή τυποποίηση με χρήση PCR PCR-SSP PCR-SSO

Μικτή λεμφοκυτταρική αντίδραση

VIII. Πειραματικά μοντέλα σε ζώα-Ποντίκια SCID γυμνό ή αθυμικό ποντίκι (nu/nu)

Διαγονιδιακά ποντίκια-έκφραση συγκεκριμένου γονιδίου διαγονίδιο έλεγχος με PCR

Κnockout ποντίκια: in vitro προετοιμασία

Κnockout ποντίκια (ομόζυγα)-διαγραφή γονιδίου

Ιστοειδική έκφραση γονιδίου (σύστημα Cre/loxP)

Σύγκριση διαγονιδιακών και knockout ποντικών Χαρακτηριστικό Διαγονιδιακό ζώο Knockout ζώο Κύτταρα που εισάγεται το DNA Ζυγωτό Εμβρυϊκά αρχέγονα κύτταρα (stem cells) Κατασκευές DNA Φυσιολογικό γονίδιο ή cDNA Μεταλλαγμένο γονίδιο Τρόπος μεταφοράς Μικροένεση στο ζυγωτό και εμφύτευση στη θετή μητέρα Μεταφορά των αρχέγονων κυττάρων σε βλαστοκύστη και εμφύτευση στη θετή μητέρα Τελικό αποτέλεσμα Εισαγωγή ενός επιπλέον γονιδίου Απώλεια ενός γονιδίου