Κλωνοποιηςη και χαρακτηριςμος του γονιδιου της περφορινης ςτην ιριδιζουςα πεςτροφα Εισαγωγή Η περφορίνη ανήκει στην τάξη των Pore Forming Toxins(PFTs),οι οποίες περιλαμβάνουν πρωτεΐνες ικανές να μεταπίπτουν από υδατοδιαλυτή μορφή σε μορφή μεμβρανικά εισερχομένου πόρου. Πιο ειδικά, ανήκει μαζί με πρωτεΐνες του συστήματος του Συμπληρώματος, στην οικογένεια MACPF. Αποθηκεύεται στα κυτταροπλασματικά κυστίδια των Τ– κυτταροτοξικών λεμφοκυττάρων (CTLs) και των κυττάρων φυσικών δολοφόνων (NK) και απελευθερώνεται εξ επαφής για να προκαλέσει λύση σε καρκινικά ή μολυσμένα από ιούς κύτταρα . Σκοπός κλωνοποίηση του cDNA του γονιδίου της περφορίνης στην ιριδίζουσα πέστροφα (Oncorhynchus mykiss) υπολογιστική επεξεργασία των προκυπτουσών αμινοξικών αλληλουχιών φυλογενετική ανάλυση μελέτη της ιστικής έκφρασης του γονιδίου  Εργαστήριο Γενικής Βιολογίας, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Σοφία Αθανασοπούλου, Δήμητρα Μαριόλη, Αγγελική Μικρού, Αναστάσιος Παπαναστασίου, Ιωάννης Κ. Ζαρκάδης

Υλικά - Μέθοδοι Δημιουργία cDNA βιβλιοθήκης σπλήνας PCR με ειδικούς εκφυλισμένους εκκινητές Ηλεκτροφόρηση/καθαρισμός/ένθεση του προϊόντος της PCR στο όχημα pGEM-T Μετασχηματισμός δεκτικών βακτηριακών κυττάρων DH5a Απομόνωση και καθαρισμός ανασυνδυασμένου πλασμιδικού DNA Προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας (DNA sequencing) Απομόνωση/κλωνοποίηση και προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας των 5΄ και 3΄ περιοχών του cDNA Προσομοίωση της αρχιτεκτονικής δομής της περφορίνης με το λογισμικό ExPASy – SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/) Φυλογενετική ανάλυση της οικογένειας MACPF με τα λογισμικά Clustal W (http://ebi.ac.uk/clustalw/) και MEGA version 3 (http:// www.megasoftware.net) Μελέτη της ιστικής έκφρασης του γονιδίου με την μέθοδο RT-PCR

Αποτελέσματα Ι Πλήρης νουκλεοτιδική(cDNA) και συναγόμενη αμινοξική αλληλουχία της περφορίνης *Σημαίνονται: η αλληλουχία Κozak, που αναγνωρίζεται από τα ριβοσώματα ως περιοχή έναρξης της μετάφρασης,οι δυο θέσεις γλυκοζυλίωσης (N-linked glykosylation sites) και το σήμα πολυαδενυλίωσης

Φυλογενετική ανάλυση της οικογένειας MACPF Αποτελέσματα ΙΙ Δομή της πρωτεΐνης της περφορίνης στην ιριδίζουσα πέστροφα Σχηματική απεικόνιση των δομών της πολυπεπτιδικής αλυσίδας της περφορίνης της ιριδίζουσας πέστροφας (589 aa): MACPF: 164-366 aa, κοινή στις πρωτεΐνες της ομώνυμης υπεροικογένειας στους ευκαρυώτες και στις βακτηριακές κυτταρολυσίνες (CDCs), εμπλέκεται στη διαμεμβρανική σύνδεση C2: 413-519 aa, περιοχή υπεύθυνη για την αρχική αντίδραση με τη μεμβράνη Φυλογενετική ανάλυση της οικογένειας MACPF Μελέτη της ιστικής έκφρασης του γονιδίου της περφορίνης Ηλεκτροφόρηση προϊόντων RT-PCR σε πήκτωμα αγαρόζης 2.5%. Η ενίσχυση του mRNA του γονιδίου της β- ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός μάρτυρας της αντίδρασης. 1.Αίμα 2. Εγκέφαλος 3. Καρδιά 4. Έντερο 5. Νεφρό 6. Ήπαρ 7. Σπλήνας

Συμπεράσματα-Συζήτηση Το cDNA της περφορίνης της πέστροφας έχει μήκος 2070 bp Η προκύπτουσα πολυπεπτιδική αλληλουχία αποτελείται από 589 αμινοξέα Παρουσιάζει ποσοστά ταυτοσημίας 64, 63, 58, 40, 40, 37 και 34% με την περφορίνη του Japanese flounder, του pufferfish, του zebrafish, του ανθρώπου, του ποντικού, της όρνιθας και του βατράχου, αντίστοιχα Περιέχει τις δυο χαρακτηριστικές συντηρημένες περιοχές των περφορινών: MACPF και C2 Φυλογενετική ανάλυση της οικογένειας MACPF δείχνει ότι η περφορίνη της πέστροφας ομαδοποιείται με τις περφορίνες άλλων τελεόστεων To γονίδιο της περφορίνης εκφράζεται, στο επίπεδο του mRNA, κυρίως στο αίμα, το έντερο, και το νεφρό, ενώ μικρότερη έκφραση παρατηρείται σε εγκέφαλο, καρδιά και σπλήνα. Ευχαριστώ