Σταυρούλα Κουλοχέρη skouloheri@med.uoa.gr

Enzyme Linked Immunosorbent Assay ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

Ορισμοί Τα αντισώματα (επίσης γνωστά και ως ανοσοσφαιρίνες Ig) είναι γ σφαιρικές πρωτεΐνες που βρίσκονται στο αίμα και χρησιμοποιούνται από το ανοσοποιητικό σύστημα για ταυτοποίηση και εξουδετέρωση ξένων ουσιών όπως βακτηρίων και ιών.

Αντισώματα του ανοσολογικού συστήματος Δομή: 2 βαρείες αλυσίδες + 2 ελαφριές αλυσίδες Δισουλφιδικοί δεσμοί 2 θέσεις πρόσδεσης με το αντιγόνο Iσότυποι: IgG, IgM, IgA, IgE, IgD

Τα αντισώματα παράγονται από τα Β λεμφοκύτταρα

Παραγωγή Αντισωμάτων Ενεση αντιγόνου (καθαρή πρωτεΐνη) σε ζώο (ποντικό , κουνέλι, κοτόπουλο) 2. Το ζώο παράγει αντισώματα που αναγνωρίζουν το αντιγόνο Abstract Immune responses to antigens may be categorised as primary or secondary responses. The primary immune response of the body to antigen occurs on the first occasion it is encountered. Depending on the nature of the antigen and the site of entry this response can take up to 14 days to resolve and leads to the generation of memory cells with a high specificity for the inducing antigen. The humoral response, mediated by B cells with the help of T cells, produces high‐affinity and antigen‐specific antibodies. This is in contrast with the CD8 T‐cell response which leads to the generation of large numbers of antigen‐specific cells that are capable of directly killing infected cells. Antigen‐specific CD4 T cells, which provide help to B cells in the form of cytokines and other stimulatory factors, can also be expanded upon antigenic stimulation. The secondary response of both B‐ and T cells is observed following subsequent encounter with the same antigen and is more rapid leading to the activation of previously generated memory cells. This has some quantitative and qualitative differences from the primary response. Key Concepts: The innate immune system is the first line of defence against infectious agents. When this is breached, the adaptive immune system provides a more efficient response to clearing pathogens. The adaptive immune system has the capacity to ‘remember’ previous antigens, a process termed immunological memory. Antigen‐specific T cells are selected during a primary immune response and expand to produce clones of T cells with high specificity for the activating antigen. In a B cell primary response to a thymus‐dependent antigen, the immune system selects B cells with a high affinity and specificity for the antigen and these become memory cells. The selection of B cells with a high affinity for a given antigen occurs in the germinal centres of secondary lymphoid follicles and requires the enzyme activation‐induced cytidine deaminase (AID) and interactions with other immune cells. The ability to change the isotype of antibody produced (class switching) by a B cell also occurs in germinal centres and requires AID. In a secondary response to the same antigen, memory cells are rapidly activated. This process is quicker and more effective than the primary response. Ενέσιμο αντιγόνο σε δόσεις περισσότερες από μία: η ανοσο απόκριση είναι υψηλότερη σε μετέπειτα ενέσεις αντιγόνου

Ορισμοί Αντιγόνα Μια ουσία που όταν εισάγεται στον οργανισμό διεγείρει την παραγωγή ενός αντισώματος. Ανοσοδοκιμασία Μια εργαστηριακή τεχνική που κάνει χρήση της πρόσδεσης ενός αντιγόνου και του ομόλογου αντισώματος για ταυτοποίηση και ποσοτικοποίηση του αντιγόνου ή αντισώματος σε ένα δείγμα. Ουσία προσδιορισμού Αντιγόνο ή αντίσωμα

Αντιγόνο Βρίσκεται φυσιολογικά στον οργανισμό όπως οι ορμόνες Βρίσκεται φυσιολογικά στον οργανισμό όπως οι ορμόνες Παράγεται ειδικά σε νοσολογικές καταστάσεις όπως για παράδειγμα η ορμόνη χοριακή γοναδοτροπίνη (HCG) η οποία φυσιολογικά παράγεται από τα κύτταρα του πλακούντα σε εγκύους, μπορεί να βρίσκεται στον οργανισμό σε μερικές μορφές καρκίνου. Δεν βρίσκεται στον οργανισμό σε φυσιολογική κατάσταση όπως τα φάρμακα.

Εισαγωγή Το Αντίσωμα: Μια ανοσοσφαιρίνη, μια ειδική ανοσο πρωτείνη, παραγόμενη εξαιτίας της εισαγωγής στον οργανισμό ενός αντιγόνου και το οποίο διακρίνεται για την σημαντική του ικανότητα να συνδυαστεί με το αντιγόνο που προκάλεσε την παραγωγή του (ειδική συγγένεια, specific affinity) Το αντιγόνο αναγνωρίζει και προσδένεται στην περιοχή του αντιγονικού του επιτόπου.

Παραγωγή Αντισωμάτων Ειδικά αντισώματα παράγονται με έγχυση ενός αντιγόνου σε ένα θηλαστικό όπως ποντικό, ή κουνέλι για μικρές ποσότητες αντισώματος ή κατσίκα, πρόβατο ή άλογο για μεγαλύτερες ποσότητες αντισωμάτων. Το αίμα που λαμβάνεται από αυτά τα ζώα περιέχει πολυκλωνικά αντισώματα- πολλαπλά αντισώματα που προσδένονται στο ίδιο αντιγόνο-στον ορό, που ονομάζεται αντιορός. Antiserum (plural: antisera) is blood serum containing polyclonal antibodies and is used to pass on passive immunity to many diseases. For example, passive antibody transfusion from a previous human survivor (convalescent serum) used to be the only known effective treatment for Ebola infection (but with little success rate).

Παραγωγή αντισωμάτων για ένα ειδικό αντιγόνο Πολυκλωνικά αντισώματα: Προέρχονται από πολλαπλούς Β-κυτταρικούς κλώνους, Αναγνωρίζουν πολλαπλούς επίτοπους στα αντιγόνα Eγχυση με το αντιγόνο Γραμμικός επίτοπος Συλλογή ορού αίματος Επίτοπος διαμόρφωσης Καθαρισμός αντισωμάτων (χρωματογραφία συγγένειας με αντιγόνο προσαρτημένο στα σφαιρίδια) “επίτοπος” = μοναδικό τμήμα του αντιγόνου που αναγνωρίζεται από το αντίσωμα

Παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων Για την λήψη αντισώματος που είναι ειδικό για ένα μοναδικό αντιγόνο, τα λεμφοκύτταρα που παρήγαγαν το αντίσωμα διαχωρίζονται από το ζώο και καθίστανται αθάνατα με σύντηξη με μια καρκινική κυτταρική σειρά. Τα συντηγμένα κύτταρα καλούνται υβριδώματα και συνεχώς θα πολλαπλασιάζονται και θα εκκρίνουν αντισώματα σε καλλιέργεια. Μοναδικά υβριδωματικά κύτταρα διαχωρίζονται με κλωνική αραίωση για την δημιουργία κυτταρικών κλώνων που παράγουν το ίδιο αντίσωμα. Αυτά τα αντισώματα καλούνται μονοκλωνικά αντισώματα

Παραγωγή αντισωμάτων για ένα ειδικό αντιγόνο Μονοκλωνικά αντισώματα Προέρχονται από κλώνο B-κυττάρου “Υβρίδωμα” Αναγνωρίζουν ένα μοναδικό επίτοπο στο αντιγόνο

enzyme hypoxanthine-guanine phosporybosyl transferase (HGPRT) HAT Medium (hypoxanthine-aminopterin-thymidine medium) is a selection medium for mammalian cell culture

Η τεχνική ELISA Είναι μια βιοχημική τεχνική που χρησιμοποιείται κυρίως στην ανοσολογία για την ανίχνευση της παρουσίας ενός αντισώματος ή μιας πρωτεΐνης σε ένα δείγμα. Η τεχνική περιλαμβάνει 1- Συναγωνιστική (Competitive) ELISA 2- Sandwich ELISA (καλείται επίσης άμεση ELISA) 3- Εμμεση ELISA

Συναγωνιστική(Competitive) ELISA Το σημασμένο αντιγόνο συναγωνίζεται με το αντιγόνο του δείγματος (μη σημασμένο) για τις θέσεις πρόσδεσης του πρωτογενούς αντισώματος. Οσο περισσότερο αντιγόνο υπάρχει στο δείγμα λιγότερο σημασμένο αντιγόνο κατακρατείται στο πηγαδάκι και ασθενέστερο το σήμα.

 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA 

Sandwich ELISA Η πλάκα της ELISA επενδύεται με το αντίσωμα για την ανίχνευση του ειδικού αντιγόνου Horseradish peroxidase,  its presence must be made visible using a substrate that, whenoxidized by HRP using hydrogen peroxide as the oxidizing agent, yields a characteristic change that is detectable byspectrophotometric methods. Numerous substrates for the horseradish peroxidase enzyme have been described and commercialized to exploit the desirable features of HRP. These substrates fall into several distinct categories. HRP catalyzes the conversion of chromogenic substrates (e.g.,TMB, DAB, ABTS) into colored products, and produces light when acting on chemiluminescent substrates (e.g. Enhanced Chemiluminescence by luminol).

Sandwich ELISA Προετοιμασία μιας επιφάνειας με μια γνωστή ποσότητα αντισώματος προσδεδεμένου. Δέσμευση των μη ειδικών θέσεων πρόσδεσης στην επιφάνεια Εφαρμογή του δείγματος που περιέχει το αντιγόνο στην πλάκα

Sandwich ELISA Εκπλυση της πλάκας, ώστε να γίνει απομάκρυνση του μη συνδεδεμένου αντιγόνου. Εφαρμογή ενζύμου συνδεδεμένου με δεύτερο αντίσωμα ως αντίσωμα ανίχνευσης ή με το αντιγόνο-στόχο το οποίο προσδένεται επίσης ειδικά με το αντιγόνο. Έκπλυση της πλάκας, ώστε το μη συνδεδεμένο σύμπλεγμα αντισώματος-ενζύμου να απομακρυνθεί

Sandwich ELISA Εφαρμογή ενός υποστρώματος το οποίο μετατρέπεται από το ένζυμο σε μια έγχρωμη ένωση. Μέτρηση της απορροφητικότητος των πηγαδιών της πλάκας για τον προσδιορισμό της παρουσίας και της ποσότητος του αντιγόνου.

Sandwich ELISA

Έμμεση ELISA Η πρωτεΐνη-αντιγόνο που πρόκειται να προσδιοριστεί προστίθεται σε κάθε πηγαδάκι της πλάκας, όπου αφήνεται κάποιο χρόνο για να προσκολληθεί στην πλαστική επιφάνεια μέσω αλληλεπιδράσεων φορτίων. Ένα διάλυμα μη αντιδρώσας πρωτεΐνης προστίθεται για να μπλοκάρει θέσεις της πλαστικής επιφάνειας του πηγαδιού που δεν καλύφθηκαν από το πρωτεϊνικό αντιγόνο.

Έμμεση ELISA Στη συνέχεια προστίθεται ο ορός ο οποίος περιέχει ένα μίγμα των αντισωμάτων αγνώστου συγκέντρωσης, μερικά από τα οποία προσδένονται ειδικά στο υπό προσδιορισμό αντιγόνο που επενδύει το πηγαδάκι. Έπειτα, ένα δεύτερο αντίσωμα προστίθεται, το οποίο προσδένεται με το αντίσωμα με το οποίο είναι προσδεδεμένο το υπό προσδιορισμό αντιγόνο στο πηγαδάκι. Αυτό το δεύτερο αντίσωμα έχει ένα ένζυμο προσαρτημένο.

Έμμεση ELISA Στη συνέχεια ένα υπόστρωμα για αυτό το ένζυμο προστίθεται.Συχνά, αυτό το ένζυμο αλλάζει χρώμα με την αντίδραση με το ένζυμο.Η αλλαγή χρώματος δείχνει ότι το δεύτερο αντίσωμα έχει προσδεθεί με το πρώτο αντίσωμα και αντανακλά την ανοσοαντίδραση με το υπό δοκιμασία αντιγόνο. Όσο υψηλότερη η συγκέντρωση του πρώτου αντισώματος που ήταν στον ορό, τόσο εντονότερη η μεταβολή χρώματος. Με την χρήση ενός φασματομέτρου λαμβάνουμε ποσοτικές τιμές ανάλογα με την ένταση του χρώματος.

Έμμεση ELISA

Παράδειγμα ενός πειράματος ELISA Πριν αρχίσουμε διαβάζουμε προσεκτικά τις οδηγείες του kit 1- Η πλάκα με τα 96 πηγαδάκια σημαίνεται προσεκτικά και τα πρώτα πηγαδάκια χρησιμοποιούνται για την χάραξη της καμπύλης των προτύπων διαλυμάτων (γνωστές συγκεντρώσεις)

Παράδειγμα ενός πειράματος ELISA Το δείγμα προστίθεται στην πλάκα εις διπλούν ή τριπλούν και υπολογίζεται ο μέσος όρος. Το δείγμα ποιοτικού ελέγχου ( quality control) που υπάρχει στο kit υφίσταται την ίδια επεξεργασία με τα υπό δοκιμασία δείγματα

Αποτελέσματα Μετά το διάβασμα των αποτελεσμάτων, χαράσσεται η πρότυπη καμπύλη όπου οι συγκεντρώσεις είναι στον άξονα Χ και οι απορροφήσεις στον άξονα Υ Absorption nm Concentration ng/ml

Αποτελέσματα Οι συγκεντρώσεις των προτύπων στον άξονα χ και οι απορροφήσεις του κάθε προτύπου στον άξονα Υ. Χάραξη της καμπύλης.

Αποτελέσματα Αυτή η καμπύλη προτύπων χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της άγνωστης συγκέντρωσης κάθε δείγματος από την απορρόφηση. Absorption nm Concentration ng/ml

Αποτελέσματα Η συγκέντρωση του δείγματος του ποιοτικού ελέγχου προσδιορίζεται από την πρότυπη καμπύλη και εάν το αποτέλεσμα εμπίπτει στην περιοχή που δίδεται από τον κατασκευαστή του kit, οι μετρήσεις γίνονται αποδεκτές.

Η πλάκα της ELISA

Πως προσδιορίζουμε συγκεντρώσεις με ανάγνωση απορροφήσεων σε συγκεκριμένο μήκος κύματος λ

Χρήσιμοι ιστότοποι για την μέθοδο ELISA http://www.edumedia-sciences.com/en/a543-direct-enzyme-linked-immunosorbent-assay-elisa http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/ELISA.html http://www.biology.ualberta.ca/facilities/multimedia/uploads/procedures/elisa-sound.swf